Nov 12, 2023
La disminución de TMIGD1 agrava la colitis y la disfunción de la barrera intestinal a través de BANF1
BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 287 (2023) Citar este artículo 1 Detalles de Altmetric Metrics La barrera epitelial intestinal alterada es una de las principales causas de la enfermedad de Crohn (EC). Novedoso
BMC Medicine volumen 21, número de artículo: 287 (2023) Citar este artículo
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La alteración de la barrera epitelial intestinal es una de las principales causas de la enfermedad de Crohn (EC). Nuevas dianas moleculares para la barrera epitelial intestinal son esenciales para el tratamiento de la EC. La proteína 1 que contiene dominios transmembrana e inmunoglobulina (TMIGD1) es una molécula de adhesión que regula la adhesión celular, la migración y la diferenciación de enterocitos. Sin embargo, rara vez se han estudiado la función y el mecanismo de TMIGD1 en la EC y la barrera epitelial intestinal. Además, la asociación entre TMIGD1 y las características clínicas de la EC sigue sin estar clara.
Se realizaron análisis de transcriptoma en la mucosa colónica de pacientes con EC e individuos sanos para identificar genes desregulados. La integración multiómica de la cohorte 1000IBD, incluida la genómica, la transcriptómica de biopsias intestinales y la proteómica sérica, identificó la asociación entre los genes y las características de la EC. La inflamación se evaluó mediante la producción de citocinas en líneas celulares, organoides y ratones knockout para Tmigd1 específicos del intestino (Tmigd1INT-KO). La integridad de la barrera epitelial se evaluó mediante la resistencia eléctrica transepitelio (TEER), la permeabilidad paracelular y la expresión del complejo de unión apical (AJC). Se utilizaron coinmunoprecipitación, ensayos desplegables de GST, espectrometría de masas, proteómica y análisis de transcriptoma para explorar los mecanismos posteriores.
La integración multiómica sugirió que TMIGD1 se asociaba negativamente con las características inflamatorias de la EC. TMIGD1 se reguló negativamente en la mucosa intestinal inflamada de pacientes con EC y modelos de colitis en ratones. Los ratones Tmigd1INT-KO eran más susceptibles a la colitis inducida químicamente. En líneas celulares epiteliales y organoides colónicos, la eliminación de TMIGD1 provocó una alteración de la integridad de la barrera intestinal, evidenciada por un aumento de la permeabilidad paracelular y una reducción de la expresión de TEER y AJC. La eliminación de TMIGD1 en las células epiteliales intestinales también indujo la producción de citoquinas proinflamatorias. Mecánicamente, TMIGD1 interactuó directamente con el factor 1 de ensamblaje nuclear BAF citoplásmico (BANF1) para inhibir la activación de NF-κB. La expresión exógena de TMIGD1 y BANF1 restableció la función de la barrera intestinal e inhibió la inflamación in vitro e in vivo. La expresión de TMIGD1 predijo la respuesta al tratamiento anti-TNF en pacientes con EC.
Nuestro estudio demostró que TMIGD1 mantenía la integridad de la barrera intestinal e inactivaba la inflamación y, por lo tanto, era un objetivo terapéutico potencial para la EC.
Informes de revisión por pares
La enfermedad de Crohn (EC) es una enfermedad gastrointestinal inflamatoria crónica que a menudo causa estenosis o fístulas en el íleon terminal, el colon y las regiones perianales [1, 2]. La barrera de la mucosa intestinal desempeña un papel crucial en el desarrollo de la EC mediante el mantenimiento de la homeostasis intestinal y está formada por la capa epitelial, la capa mucosa, la inmunidad mucosa y la microbiota comensal [3, 4]. La capa epitelial es la piedra angular de la homeostasis intestinal debido a su participación en la separación física del medio interno de la luz, la modulación de la secreción de moco, la comunicación entre la microbiota y el huésped y el ajuste de las respuestas inmunes a través de diversos subtipos de células epiteliales [5]. Los defectos de integridad de la barrera epitelial se caracterizan principalmente por daño en el complejo de unión apical (AJC), que incluye uniones estrechas, uniones por adhesión y desmosomas [6]. Después de una lesión inflamatoria, la desregulación de las proteínas AJC aumenta la permeabilidad intestinal y, por lo tanto, agrava la colitis [7]. Sin embargo, se requiere más investigación para desarrollar nuevos objetivos moleculares para recuperar la integridad epitelial y aliviar la inflamación.
El dominio transmembrana e inmunoglobulina que contiene 1 (TMIGD1), que consta de dos dominios extracelulares de inmunoglobulina (Ig), un dominio transmembrana y un dominio intracelular, se transporta desde el citoplasma a la unión intercelular [8]. TMIGD1 es un componente del borde en cepillo y se localiza en la región de la base proximal de las microvellosidades en las células epiteliales intestinales [9]. TMIGD1 funciona como receptor de adhesión y supresor de tumores [10]. Reclutado por EBP50 y E3KARP en el borde en cepillo, TMIGD1 mantiene la formación de microvellosidades. TMIGD1 se une a proteínas de unión al citoesqueleto, como moesina y ezrin, y regula la adhesión y migración celular [11, 12]. TMIGD1 también regula la permeabilidad transepitelial y protege las células epiteliales tubulares renales del daño oxidativo [8]. Además, TMIGD1 muestra una tendencia a la baja en la mucosa intestinal normal, lesiones no polipoides, lesiones polipoides y cáncer de colon [13]. TMIGD1 induce la detención del ciclo celular en la fase G2/M y la diferenciación de enterocitos; La deficiencia de TMIGD1 altera la maduración de los epitelios intestinales y conduce a una organización apicobasal deformada en las microvellosidades del ratón [13, 14]. Aunque se ha informado que la expresión de TMIGD1 disminuye significativamente en la mucosa de la EC [15], rara vez se ha estudiado la función y el mecanismo de TMIGD1 en la EC y la barrera intestinal. Además, la asociación entre TMIGD1 y las características clínicas de la EC sigue sin estar clara.
En este estudio, realizamos un análisis del transcriptoma en la mucosa colónica de pacientes internos y una integración multiómica utilizando el conjunto de datos de la cohorte 1000IBD, que incluye genómica, transcriptómica de biopsias intestinales y proteómica sérica. Descubrimos que la regulación negativa de TMIGD1 se asociaba con características inflamatorias más graves en la EC. También generamos ratones knockout para Tmigd1 específicos del intestino (Tmigd1INT-KO), líneas celulares y organoides colónicos para demostrar que la disminución de TMIGD1 promovía la inflamación y desencadenaba una disfunción de la barrera. Además, desvelamos un nuevo mecanismo molecular: la interacción directa entre TMIGD1 y el factor 1 de ensamblaje nuclear citoplasmático de BAF (BANF1) inhibe la vía NF-κB.
El estudio en humanos fue aprobado por la Junta Institucional del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, y también se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes ([2022] No. 252). Todas las muestras humanas se recolectaron mediante biopsia endoscópica del Departamento de Gastroenterología, el primer hospital afiliado de la Universidad Sun Yat-sen. El diagnóstico de EC se basó en exámenes clínicos, radiológicos, endoscópicos e histológicos de acuerdo con las directrices de la Organización Europea de Crohn y Colitis [16]. El índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI), la puntuación endoscópica simple para la enfermedad de Crohn (SES-CD) y la puntuación de actividad histológica de Geboes (GHAS) se evaluaron según protocolos [17,18,19].
El conjunto de datos de la cohorte 1000IBD (EGAS00001002702) se basó en una cohorte bien establecida de enfermedad inflamatoria intestinal del Centro Médico Universitario de Groningen que contenía 1215 pacientes [20]. La información genómica fue generada por Global Screening Array y secuenciación del exoma completo para todos los pacientes. Los datos transcriptómicos intestinales se detectaron mediante secuenciación masiva de ARNm para 171 pacientes. Los biomarcadores inflamatorios séricos se midieron mediante el ensayo de extensión de proximidad Olink en 1026 pacientes. Para explorar los antecedentes genéticos de TMIGD1 y sus supuestos efectos sobre los rasgos moleculares posteriores, recuperamos 831 variantes genómicas con una frecuencia de alelo menor> 5% ubicada ± 1 Mb alrededor del centro del gen TMIGD1. Estas variantes se seleccionaron para detectar efectos reguladores sobre la expresión génica, que se definieron como cis-eQTL [21]. También se utilizaron variantes genómicas para determinar sus asociaciones con biomarcadores inflamatorios (loci de rasgos cuantitativos de proteínas, pQTL) [22]. Los pacientes con sólo alelos de referencia se codificaron como 0, mientras que los heterocigotos y homocigotos de alelos alternativos se codificaron como 1 y 2, respectivamente. Todos los efectos de QTL se evaluaron mediante modelos lineales generalizados según nuestros estudios anteriores [21, 22].
Todos los protocolos de experimentación con animales fueron aprobados por la Junta Institucional del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen ([2021] No. 028). Todos los ratones tenían antecedentes C57BL/6J. Se cruzaron ratones Tmigd1-floxed sin Villin-Cre (ratones de control, WT) con ratones Villin-Cre para generar ratones Tmigd1INT-KO (Shanghai Model Organisms Company, China). Los ratones se mantuvieron separados después del destete a las cuatro semanas de edad. Los ratones se criaron a 23 ℃ ± 3 ℃ y 35 % ± 5 % de humedad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en una instalación específica libre de patógenos. Se indujeron modelos agudos de colitis mediante la administración de sulfato de dextrano sódico (DSS) al 2,5 % (160110, MP Biomedicals, EE. UU.) a través del agua potable o ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) (P2297, Sigma-Aldrich, EE. UU.) a través de un enema intrarrectal a ratones de 6 a 8 semanas de edad, como lo describen Wirtz et al. [23]. El índice de actividad de la enfermedad (IAD) se determinó mediante la pérdida de peso, la consistencia de las heces y el sangrado intestinal. Las puntuaciones endoscópicas y histológicas para la colitis inducida por DSS y TNBS se calcularon según el protocolo clásico [23]. Se administraron adenovirus para la sobreexpresión de Tmigd1 y Banf1 y los virus de control a ratones mediante inyección intraperitoneal.
Caco2, una línea celular de adenocarcinoma epitelial de colon, se adquirió de la American Tissue Culture Collection (ATCC, EE. UU.) y se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; C11995500BT, Gibco, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (10099-141C, Gibco, EE.UU.) y antibióticos al 1% (15140-122, Invitrogen, EE.UU.). NCM460, una línea celular epitelial del colon, se adquirió de Incell Corporation LLC (INCELL, EE. UU.) y se cultivó en medio M3:BaseF (M300F, INCELL, EE. UU.) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 1 % de antibióticos. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37°C durante no más de 2 meses.
El aislamiento y el cultivo de la cripta se realizaron como lo describen Lukonin et al. [24]. Los tejidos del colon se diseccionaron, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS; BL601A, Biosharp, CHN) y se cortaron en trozos pequeños. Las vellosidades se lavaron completamente con PBS helado pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que el sobrenadante se volvió claro. Los trozos de tejido se incubaron en el reactivo de disociación celular suave (n.º 100-0485, Stemcell Technologies, CAN) durante 30 minutos (muestras humanas) o 15 minutos (muestras de ratón) con agitación. Después de pipetear vigorosamente, filtrar a través de un filtro celular de 70 μm (352350, Corning, EE. UU.) y lavar, se recogieron las criptas del colon y se sembraron en Matrigel (356231, Corning, EE. UU.) suplementado con medio de crecimiento organoide ItestiCult™ (06005 y 06010, Tecnologías de células madre, CAN). Los organoides se cultivaron en CO2 al 5 % a 37 °C durante al menos siete días antes de su uso. El medio se reemplazó cada 2 días y los organoides se pasaron una vez por semana.
Las células y los tejidos se lisaron utilizando tampón de lisis (20-188, MERCK, GER) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (5872, CST, EE. UU.). Las muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de la incubación con anticuerpos primarios a 4°C durante la noche, las membranas se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) a 25°C durante 2 h. Las transferencias se visualizaron utilizando el sistema iBright™ CL1500 (Thermo Scientific, EE. UU.). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1.
Los tejidos de colon frescos se fijaron en paraformaldehído al 4% (P1110, Solarbio, CHN) y se incluyeron en parafina. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y luego con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 30 minutos a 25°C. Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. La detección posterior se realizó mediante detección de sustrato utilizando DAB (8059, CST, EE. UU.). Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio BX51 (Olympus, JPN) y un sistema AxioScan Z1 (Zeiss, GER).
Se hidrataron secciones de tejidos de colon incluidas en parafina en xileno y etanol en gradiente y luego se bloquearon con suero de cabra. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C, seguidas de anticuerpos secundarios y se conservaron en medio de montaje anti-desvanecimiento suplementado con DAPI (P36981, Invitrogen, EE. UU.). La fluorescencia se detectó utilizando un microscopio confocal LSM780 (Zeiss, GER). Los anticuerpos utilizados en este estudio se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1.
El ARN total se extrajo de células o tejidos utilizando TRIzol (15596026, Thermo Scientific, EE. UU.). El ARN total del modelo de colitis inducida por DSS se purificó con cloruro de litio para evitar una posible inhibición de qPCR por DSS [25]. Se utilizó el kit de síntesis de ADNc Transcript First Stand (04897030001, Roche, Basilea, Suiza) para la transcripción inversa y Fast Start Universal SYBR Green (12239264001, Roche, Basilea, Suiza) para qPCR. La cuantificación relativa de la expresión de ARNm se realizó mediante el método delta-delta Ct (ΔΔCt). Las secuencias de los cebadores se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S2.
Se prefijaron trozos de tejido colónico durante la noche a 4 °C y luego se fijaron posteriormente con OsO4 al 1% durante 2 h a 25 ℃. Después de la deshidratación y la inclusión en resina epoxi, los bloques de resina se cortaron a un espesor de 60 a 80 nm en un ultramicrótomo (Leica UC7, GER) y se pescaron en rejillas de cuprum de malla 150 con una película formvar. Las rejillas se contrastaron aún más utilizando acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo al 2,6%. Finalmente, se observaron rejillas de cuprum bajo microscopía electrónica de transmisión (TEM) (HITACHI HT7800, JPN) operando a 80,0 kV. Se realizaron exámenes de la longitud de las microvellosidades en un total de 30 microvellosidades seccionadas longitudinalmente por muestra. Los exámenes de los espacios AJC se realizaron en un total de 10 regiones de unión de células epiteliales del colon seccionadas longitudinalmente por muestra.
La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) representa la permeabilidad paracelular del modelo celular monocapa Caco2. Se sembraron células Caco2 en la cámara superior de una cámara transwell de 12 pocillos y 0,4 μm (3460, Corning, EE. UU.) a una densidad de 5 x 104 células/pocillo. Después de 2 semanas, se midió TEER utilizando un Millicell ERS-2 (Millipore, GER).
Para ratones, se disolvió polvo de isotiocianato de fluoresceína-dextrano (FD4; 60842-46-8, Sigma, EE. UU.) de 4 kD en PBS para obtener una solución de 80 mg/ml. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 h antes de la alimentación forzada con 150 µl de solución de FD4. Tres horas después de la alimentación forzada, los ratones fueron anestesiados y se les extrajo sangre y se mantuvo en la oscuridad. La fuga de FD4 a la circulación se determinó midiendo la fluorescencia sérica (λex/λem = 485/535 nm; TECAN Infinite F500, AUT). Para las células, el polvo de FD4 se disolvió en Opti-MEM (31985070, Gibco, EE. UU.) para obtener una solución de 2 mg/ml. Se añadió solución FD4 a la cámara Transwell superior y se añadió Opti-MEM a la cámara inferior. Después de una incubación durante 4 h, se detectó la intensidad de fluorescencia de la cámara inferior (λex/λem = 485/535 nm; TECAN Infinite F500, AUT). Para los organoides, se añadió FD4 al medio de cultivo como lo describen Xu et al. [26]. La intensidad de la fluorescencia dentro del organoide se cuantificó utilizando un microscopio confocal LSM780 (Zeiss, GER).
Los plásmidos de sobreexpresión para TMIGD1, BANF1 y sus controles etiquetados con FLAG fueron diseñados y sintetizados por OBiO Technology Corp., Ltd. (Shanghai, CHN). Los plásmidos de ARNi para TMIGD1, BANF1 y sus controles se adquirieron en Shanghai GENECHEM Corp., Ltd. (Shanghai, CHN). La transfección de plásmidos se realizó utilizando Lipofectamine™ 3000 (L3000001, Thermo Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Las dos empresas antes mencionadas sintetizaron lentivirus de sobreexpresión y ARNi para TMIGD1, BANF1 y sus controles. La eficacia de la infección se evaluó mediante qPCR y transferencia Western. Las secuencias objetivo fueron las siguientes:
Caída de TMIGD1: CGTGAGATGACAAGTTCTGTT;
Caída de BANF1: CTTCGGATGCCTTCGAGAGTG;
La inmunoprecipitación se realizó según las instrucciones del fabricante (90409, Thermo Scientific, EE. UU.). Después de la preparación del lisado celular, se agregaron anticuerpos específicos e IgG de control por separado a cada alícuota y las muestras se rotaron a 4 °C durante la noche. Luego, el complejo antígeno-anticuerpo se unió a perlas magnéticas de proteína A/G durante 1 hora a 25 ℃. A continuación se lavó repetidamente el complejo de perla magnética-anticuerpo-antígeno. Finalmente, los sobrenadantes del inmunocomplejo fueron eluidos y sometidos a análisis posterior.
Los ensayos desplegables de GST se realizaron según el protocolo del fabricante (21516, Thermo Scientific, EE. UU.). La proteína TMIGD1 recombinante purificada etiquetada con GST (TMIGD1-GST; H00388364-P01, Abnova, CHN) se incubó con glutatión agarosa a 4 ° C durante 2 h. Después de lavar cinco veces, el glutatión agarosa se incubó con la proteína BANF1 marcada con FLAG (BANF1-Flag; TP303270, Origene, CHN) a 4 ° C durante 2 h. Después de lavar cinco veces, la elución se analizó mediante transferencia Western.
Las fracciones nuclear y citoplasmática se extrajeron por separado utilizando el kit de fraccionamiento citoplasmático y nuclear Minute™ (SC-003, Invent Biotechnologies, EE. UU.). Se utilizó β-actina como control citoplasmático y Lamin B1 como control nuclear para el análisis de transferencia Western. La actividad de unión al ADN de p65 nuclear se detectó mediante ensayos del factor de transcripción NF-κB p65 (ab210613, Abcam, Reino Unido).
Los niveles de expresión en suero murino de ocho citocinas, incluidas IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-33 y TNF-α, se midieron utilizando un kit de ensayo de citoquinas Luminex (LXSAMSM-06, R&D Systems, EE.UU.) y un instrumento Luminex X-200 según el protocolo del fabricante (R&D Systems, EE.UU.).
Para el análisis estadístico se utilizó el paquete estadístico IBM para ciencias sociales (SPSS v26.0, EE. UU.). Los datos faltantes se excluyeron de todos los análisis estadísticos. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Para analizar los conjuntos de datos se utilizaron la prueba t de Student de dos colas no pareada, el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. El análisis de correlación no paramétrico se realizó mediante correlación de Spearman. Se utilizó regresión logística para predecir la respuesta anti-TNF con la expresión del ARNm de TMIGD1 antes del tratamiento anti-TNF. El conjunto de datos de la cohorte RISK se dividió en conjuntos de tren (60%) y de prueba (40%). El entrenamiento del modelo se realizó mediante una validación cruzada quíntuple. El nivel de significancia se definió como p<0,05. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
En este estudio se incluyeron dos conjuntos de datos: datos internos de pacientes chinos con EC y la cohorte holandesa 1000IBD. El análisis de datos transcriptómicos internos identificó 530 genes desregulados (417 regulados positivamente y 113 regulados negativamente) en la mucosa colónica inflamada de pacientes con EC en comparación con la mucosa no inflamada de individuos sanos (|cambio log2 veces|≥1 y p<0,05, Fig. 1A ). Para identificar los genes más relacionados con las características inflamatorias generales de la EC, luego determinamos los 30 genes cuya expresión está más fuertemente correlacionada con CDAI, proteína C reactiva (CRP), SES-CD y GHAS (Fig. 1B y archivo adicional 1: Tabla S3). Sólo TMIGD1 y H2AC11 mostraron una correlación significativa con todas las características inflamatorias (Fig. 1C). Dado que TMIGD1 se expresa principalmente en el intestino, investigamos el papel de TMIGD1 en el desarrollo de la EC [13]. Realizamos una integración multiómica utilizando el conjunto de datos de la cohorte 1000IBD, incluida la genómica, la transcriptómica de biopsias intestinales y la proteómica sérica (Fig. 1D). Se observó que 278 variantes genómicas significativas cercanas a TMIGD1 ejercían potencialmente efectos de loci cuantitativos de expresión cis (cis-eQTL) en la expresión de TMIGD1 (Fig. 1E y F, archivo adicional 2). Además, estas variantes cis-eQTL también se asociaron con numerosas proteínas proinflamatorias de la EC en suero (p. ej., IL-2, TWEAK e IFN-γ; Fig. 1G y H, archivo adicional 3). En total, los pacientes portadores de variantes genómicas de TMIGD1 mostraron características inflamatorias alteradas.
La integración multiómica indica que TMIGD1 se correlaciona negativamente con las características inflamatorias de la EC. Un mapa de calor de nuestro conjunto de datos interno que muestra una expresión diferente de ARNm en pacientes con EC (n=7) frente a individuos sanos (NC, n=10). La punta de flecha indica el nivel de expresión de TMIGD1. B Lista de los 30 genes principales correlacionados con CDAI, CRP, SES-CD y GHAS; el valor absoluto de Spearman r mediante análisis de correlación entre el FPKM de los genes y CDAI, CRP, SES-CD y GHAS. C Diagrama de Venn que muestra los genes comunes en los cuatro grupos. D Integración de datos multiómicos de la cohorte holandesa 1000IBD, incluida información genómica de 1125 pacientes, datos transcriptómicos de biopsias intestinales de 171 pacientes y datos proteómicos de Olink en suero de 1026 pacientes. E El panel superior indica el valor −log10 p de cis-eQTL dentro de una región de ±1 Mb alrededor del centro del gen TMIGD1. El panel inferior indica el desequilibrio de ligamiento (LD, R2) de 831 variantes. F Ejemplos de cis-eQTL significativos. 0, 1 y 2 indican los homocigotos de alelos de referencia, heterocigotos y homocigotos de alelos alternativos en pacientes, respectivamente. El eje Y indica el recuento de expresión genética normalizada. G, H Ejemplos de asociaciones significativas entre variantes cis-eQTL y proteínas proinflamatorias en suero. El azul en (G) indica las asociaciones negativas, mientras que el rojo indica las asociaciones positivas. Los valores alrededor del círculo representan el tamaño del efecto absoluto generado a partir del modelo lineal. El eje Y en (H) muestra los valores de expresión normalizados de las proteínas séricas.
Luego investigamos el fenotipo de los cambios en la expresión de TMIGD1. TMIGD1 se reguló negativamente en la mucosa intestinal inflamada de pacientes con EC en el conjunto de datos interno (0,294 veces, p = 0,034) y en la cohorte 1000IBD (0,339 veces, p <0,001; Fig. 2A). También se confirmó una disminución del ARNm de TMIGD1 en la mucosa intestinal inflamada de pacientes con EC en comparación con la mucosa no inflamada de individuos sanos (0,284 veces, p <0,001, Fig. 2B y archivo adicional 1: Tabla S4). La expresión de la proteína TMIGD1 también se redujo constantemente (Fig. 2C). El análisis de los datos de secuenciación unicelular de muestras de biopsia de colon humano (GSE116222) reveló que TMIGD1 se expresaba preferentemente en células epiteliales (Fig. 2D) [5]. La tinción por inmunohistoquímica (IHC) también mostró que la proteína TMIGD1 estaba ubicada principalmente en la membrana celular y el citoplasma de las células epiteliales (Fig. 2E). La intensidad de la tinción disminuyó, mientras que el CDAI aumentó (Fig. 2E, F y archivo adicional 1: Tabla S5). Además, la intensidad de la tinción de TMIGD1 se correlacionó negativamente con CRP, SES-CD y GHAS (Spearman r = −0,728 y p<0,001 para CRP; Spearman r = −0,700 y p<0,001 para SES-CD; Spearman r = − 0,734 y p<0,001 para GHAS (Fig. 2G). Por lo tanto, la regulación negativa de TMIGD1 se asoció con una inflamación más grave en pacientes con EC.
La expresión de TMIGD1 disminuye en la mucosa intestinal de pacientes con EC y ratones con colitis inducida químicamente. Una expresión de ARNm de TMIGD1 en la mucosa intestinal en el conjunto de datos interno (NC, n = 10; CD, n = 7; izquierda) y en la cohorte 1000IBD (NC, n = 107; CD, n = 64; derecha). B La expresión del ARNm de TMIGD1 en la mucosa intestinal humana se evaluó mediante qPCR (NC, n = 55; CD, n = 64). C El nivel de proteína TMIGD1 en la mucosa del colon humano. Gráfico D UMAP que muestra células individuales, que están coloreadas según los grupos vecinos más cercanos y los tipos de células compartidos según la secuenciación de células individuales de muestras de biopsia de colon humano (n = 9) del conjunto de datos GSE116222 (izquierda). El gráfico de características demuestra la expresión de TMIGD1, y cada punto representa una sola celda (en el medio). Expresión relativa de ARNm de TMIGD1 en diferentes tipos de células (derecha). E Imágenes IHC representativas de secciones de colon teñidas con TMIGD1 de NC y diferentes etapas de EC. Barras de escala, 200 μm (arriba) y 50 μm (abajo). F La intensidad de la tinción de secciones de colon teñidas con TMIGD1 (NC, n=13; CDAI<150, n=10; 150≤CDAI<220, n=12; 220≤CDAI<450, n=15; CDAI≥450, n =5). La intensidad de la tinción del área positiva se cuantificó utilizando el software ImageJ. Análisis de correlación de G Spearman entre la intensidad de tinción de TMIGD1 y CRP, SES-CD y GHAS (n = 42). H La expresión del ARNm de Tmigd1 en colitis inducida por DSS (agua, n = 8 y DSS, n = 10) y inducida por TNBS (alcohol, n = 10; TNBS, n = 10) se examinó mediante qPCR. I La expresión de la proteína Tmigd1 en la colitis inducida por DSS (arriba) y TNBS (abajo). J La expresión de la proteína Tmigd1 en la colitis inducida por DSS (arriba) y TNBS (abajo) se midió mediante IHC. Barras de escala, 100 μm. Los datos se expresan como media ± SEM. *p<0,05, ***p<0,001
Se establecieron modelos de ratones con colitis inducida por DSS y TNBS. Se detectó una regulación negativa tanto del ARNm de Tmigd1 (0,335 veces, p <0,001 en colitis inducida por DSS; 0,245 veces, p <0,001 en colitis inducida por TNBS) como de los niveles de proteína en el epitelio colónico murino (Fig. 2H-J). En conjunto, la regulación negativa de TMIGD1 puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de la EC.
Para investigar el papel de TMIGD1 en el desarrollo de CD, se generaron ratones Tmigd1INT-KO y Tmigd1-floxed sin Villin-Cre (WT) (archivo adicional 1: Fig. S1). Los ratones Tmigd1INT-KO con colitis inducida por DSS mostraron una mayor pérdida de peso corporal, diarrea con sangre más grave, mayor actividad de la enfermedad y colones más cortos que los ratones WT tratados con DSS (Fig. 3A-D, archivo adicional 1: Fig. S2A). También se observó daño histológico más severo, como daño epitelial del colon e infiltración de linfocitos de la lámina propia, en ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS (Fig. 3E, F). Además, los ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS mostraron daños endoscópicos más graves, como mucosa sangrante, patrón vascular alterado y úlceras (Fig. 3G, H). A continuación, examinamos si los ratones Tmigd1INT-KO eran más susceptibles a la colitis aguda inducida por TNBS. En comparación con los ratones WT, los ratones Tmigd1INT-KO tratados con TNBS perdieron más peso corporal y mostraron un acortamiento del colon más significativo (Fig. 3I-K, archivo adicional 1: Fig. S2B). El análisis histológico también mostró un daño tisular más grave con distorsión de la arquitectura de la glándula, edema tisular y aumento de la infiltración de células inflamatorias en ratones Tmigd1INT-KO tratados con TNBS (Fig. 3L y M).
Los ratones Tmigd1INT-KO están predispuestos a la colitis aguda inducida químicamente. A, B Peso corporal y puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI); WT+agua (n=8), Tmigd1INT-KO+agua (n=8), WT+DSS (n=10), Tmigd1INT-KO+DSS (n=12). C Imágenes representativas de colon de ratón. D Longitud del colon; WT+agua (n=8), Tmigd1INT-KO+agua (n=8), WT+DSS (n=10), Tmigd1INT-KO+DSS (n=12). E Imágenes histopatológicas colónicas representativas. Barras de escala, 200 μm. F Puntuaciones histológicas; WT+agua (n=8), Tmigd1INT-KO+agua (n=8), WT+DSS (n=10), Tmigd1INT-KO+DSS (n=12). G Imágenes representativas de colonoscopia. H Puntuaciones endoscópicas. Cada grupo, n=3. I, J Peso corporal y longitud del colon; WT+Alcohol (n=10), Tmigd1INT-KO+Alcohol (n=10), WT+TNBS (n=10), Tmigd1INT-KO+TNBS (n=15). K Imágenes representativas de colon de ratón. L Imágenes histopatológicas colónicas representativas. Barras de escala, 200 μm. M Puntuaciones histológicas; WT+Alcohol (n=10), Tmigd1INT-KO+Alcohol (n=10), WT+TNBS (n=10), Tmigd1INT-KO+TNBS (n=15). Los datos se expresan como media ± SEM. ns, sin significancia, * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001
Para explorar la función biológica de TMIGD1 desregulado, se realizó un análisis transcriptómico de tejidos colónicos de ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS y compañeros de camada WT tratados con DSS. Se observó una mayor expresión de citoquinas proinflamatorias (p. ej., Ils, Cxcls y Ccls) y una expresión reducida de marcadores de barrera epitelial (p. ej., Cdhs, Cldns y Tjps) en ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS (Fig. 4A). El análisis de ontología genética (GO) reveló un enriquecimiento de las uniones célula-célula, las respuestas inflamatorias y la producción de TNF (Fig. 4B). Además evaluamos marcadores de inflamación in vivo. Tanto los neutrófilos como las células T CD4+ estaban regulados positivamente en el tejido colónico de ratones Tmigd1INT-KO con colitis aguda (Fig. 4C, archivo adicional 1: Fig. S2C-S2D). Además, las citocinas proinflamatorias aumentaron notablemente en los ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS y TNBS (Fig. 4D, archivo adicional 1: Fig. S2E-S2F). En cuanto a la función de barrera mucosa, los ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS y TNBS mostraron una mayor permeabilidad transepitelial de FD4 (Fig. 4E y archivo adicional 1: Fig. S3A). El tejido de colon de ratones Tmigd1INT-KO con colitis inducida químicamente mostró una disminución de las proteínas del complejo de unión estrecha y de unión de adherencia (archivo adicional 1: Fig. S3B-S3G). Además, TEM reveló microvellosidades más cortas y menos, complejos de unión intracelular más dañados y un mayor espacio paracelular con dilatación sacular en ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS y TNBS (Fig. 4F, G y archivo adicional 1: Fig. S3H-S3I ).
La regulación negativa de TMIGD1 agrava la inflamación y debilita la función de la barrera epitelial intestinal en el entorno inflamatorio. Un análisis transcriptómico de genes relacionados con la función de barrera epitelial y citocinas inflamatorias en los tejidos del colon de ratones WT+DSS y Tmigd1INT-KO+DSS. B Los genes diferenciados se enriquecieron en función de barrera y citocinas relevantes para la inflamación según el análisis de ontología genética (GO). C Actividad mieloperoxidasa (MPO) en tejidos del colon; WT+agua (n=8), Tmigd1INT-KO+agua (n=8), WT+DSS (n=10), Tmigd1INT-KO+DSS (n=12); WT+Alcohol (n=10), Tmigd1INT-KO+Alcohol (n=10), WT+TNBS (n=10), Tmigd1INT-KO+TNBS (n=15). D Las concentraciones séricas de TNF-α e IL-6 se analizaron utilizando multiELISA; Cada grupo, n=5. E La concentración de FD4 sérica; WT+agua (n=5), Tmigd1INT-KO+agua (n=5), WT+DSS (n=6), Tmigd1INT-KO+DSS (n=8). F Medición de la longitud de las microvellosidades y los espacios AJC en células epiteliales del colon mediante TEM. Cada grupo, n=3. G Imágenes TEM representativas de la mucosa colónica. Las puntas de flecha indican AJC. Barras de escala, 500 nm. Permeabilidad H, I TEER y FD4 del modelo celular monocapa Caco2 después de la estimulación con TNF-α. J, K La expresión de proteínas AJC (J) y ARNm de citocinas relevantes para la inflamación y ARNm de AJC (K) en células NCM460 después de la estimulación con TNF-α. L Después del tratamiento con TNF-α, se detectó la permeabilidad a FD4 de los organoides del colon humano mediante microscopía confocal. Barras de escala, 100 μm. M La permeabilidad FD4 de los organoides colónicos de ratones Tmigd1INT-KO y WT se detectó mediante microscopía confocal antes y después del tratamiento con TNF-α. Barras de escala, 100 μm. Los datos se expresan como media ± SEM. ns, sin significancia, * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001
La función biológica de TMIGD1 también se confirmó in vitro. Primero, para determinar qué factor inflamatorio contribuyó a la disminución de la expresión de TMIGD1, tratamos las líneas celulares NCM460 y Caco2 con citocinas relevantes para CD durante 48 h. Descubrimos que solo el TNF-α reguló significativamente a la baja la expresión de TMIGD1 en ambas líneas celulares (archivo adicional 1: Fig. S4A). Además, el TNF-α indujo una disminución de la expresión de TMIGD1 de manera dependiente de la dosis (archivo adicional 1: Fig. S4B). El tratamiento con TNF-α (20 ng/mL) durante 48 h se consideró eficaz y se utilizó para experimentos in vitro posteriores. En segundo lugar, medimos la permeabilidad de TEER y FD4 paracelular en el modelo de células monocapa Caco2 para evaluar la rigidez de las uniones entre las células del colon adyacentes y la función de la barrera epitelial intestinal. En comparación con el grupo de control, las células que sobreexpresan TMIGD1 mostraron un aumento de TEER y una permeabilidad reducida de FD4 después del tratamiento con TNF-α, mientras que la eliminación de TMIGD1 condujo a una disminución de TEER y un aumento de la permeabilidad de FD4 (Fig. 4H, I). La expresión de los componentes de AJC también confirmó que TMIGD1 protegía la función de la barrera epitelial intestinal después del tratamiento con TNF-α, como lo demuestra la regulación positiva de CLDN3, CLDN4, ZO-1 y E-cadherina en células sobreexpresadas con TMIGD1 (Fig. 4J, K, Archivo adicional 1: Fig. S5A-S5B). En tercer lugar, las citocinas proinflamatorias (p. ej., IL-1β, IL-6 y TNF-α) se regularon negativamente en las líneas celulares que sobreexpresan TMIGD1 y se regularon positivamente en las líneas celulares inactivadas de TMIGD1, lo que indica además que TMIGD1 inhibió la inflamación (Fig. 4K, archivo 1: Fig. S5B).
Finalmente, generamos organoides colónicos humanos sobreexpresados y eliminados de TMIGD1 utilizando un sistema lentiviral (archivo adicional 1: Fig. S5C-S5D). Después del tratamiento con TNF-α durante 48 h, se añadió FD4 al medio de cultivo y se evaluó la función de barrera. FD4 se observó exclusivamente en organoides de eliminación de TMIGD1 bajo microscopía confocal, lo que indica que TMIGD1 ayudó a mantener la integridad epitelial intacta (Fig. 4L). De manera similar, se generaron organoides colónicos de ratones Tmigd1INT-KO y WT (archivo adicional 1: Fig. S5E-S5F). Después del tratamiento con TNF-α y la suplementación con FD4, los organoides de ratones Tmigd1INT-KO mostraron señales intraluminales de FD4 más intensas que las generadas a partir de ratones WT (Fig. 4M).
Para dilucidar los posibles mecanismos moleculares de TMIGD1, generamos líneas celulares NCM460 y Caco2 que sobreexpresan TMIGD1 etiquetado con FLAG (archivo adicional 1: Fig. S6A). Se realizaron purificación por inmunoafinidad (IP), espectrometría de masas de alto rendimiento (LC-MS/MS) y análisis proteómico para identificar posibles socios de interacción de la proteína TMIGD1 (Fig. 5A, archivo adicional 1: Fig. S6B). Entre las diversas proteínas diana potenciales, BANF1 se enriqueció en líneas celulares NCM460 (15,8 veces) y Caco2 (2,7 veces) y se identificó como un candidato principal (Fig. 5B, archivo adicional 1: Fig. S6C-S6E). La interacción directa entre TMIGD1 y BANF1 se confirmó aún más mediante ensayos de co-inmunoprecipitación (co-IP) y de extracción de GST (Fig. 5C-E). La colocalización de TMIGD1 y BANF1 en el citoplasma también respaldó su interacción directa (Fig. 5F). Tanto TMIGD1 como BANF1 disminuyeron en el epitelio colónico de pacientes con EC en comparación con la expresión en individuos sanos (Fig. 5G). Además, se observó una reducción significativa en el nivel de proteína BANF1 en ratones Tmigd1INT-KO en comparación con ratones WT tratados con DSS o TNBS (Fig. 5H, archivo adicional 1: Fig. S7A). Los niveles de BANF1 aumentaron después de la expresión ectópica de TMIGD1, mientras que se detectó una disminución en BANF1 después de la eliminación de TMIGD1 en líneas celulares (Fig. 5I, archivo adicional 1: Fig. S7B). Por tanto, la interacción TMIGD1-BANF1 puede actuar sinérgicamente en las vías posteriores.
TMIGD1 interactúa directamente con BANF1 y modula la vía NF-κB. Una tinción de plata identificó el complejo de proteína TMIGD1 inmunoprecipitado por anticuerpo anti-IgG o anti-FLAG de los lisados de células NCM460 transfectadas con lentivirus que sobreexpresan TMIGD1 etiquetado con FLAG. Las puntas de flecha indican bandas de TMIGD1 y BANF1. B El análisis proteómico mostró las 15 proteínas más enriquecidas del inmunoprecipitado del anticuerpo anti-FLAG. C, D Inmunoprecipitado por anticuerpo anti-FLAG (C) o anticuerpo anti-BANF1 (D) de los lisados de células NCM460 transfectadas con lentivirus que sobreexpresan TMIGD1 etiquetado con FLAG. Se utilizó lisado IP (10%) como entrada. E Ensayos desplegables de GST de proteínas TMIGD1-GST y BANF1-Flag recombinantes purificadas. F, G El microscopio confocal mostró colocalización de TMIGD1 y BANF1 en células NCM460 (F) y mucosa epitelial humana (G). Barras de escala, 20 m para células NCM460 y 100 m para mucosa epitelial humana. Niveles de proteína H de BANF1, p65 y p65 fosforilada. I Niveles de proteína de BANF1, p65 y p65 fosforilada después de la estimulación con TNF-α en células NCM460. J GSEA reveló un enriquecimiento significativo de la vía NF-κB. Los genes K relevantes para la vía NF-κB se enriquecieron en la comparación de los grupos WT+DSS y Tmigd1INT-KO+DSS según el análisis KEGG. L Después de la estimulación con TNF-α, el nivel de proteína p65 en las fracciones citoplasmáticas y nucleares (abajo) y los resultados del ensayo de unión del factor de transcripción de p65 nuclear (arriba) de células NCM460. Los datos se expresan como media ± SEM. ***p<0,001
Analizamos los datos transcriptómicos obtenidos de los tejidos colónicos de ratones Tmigd1INT-KO y WT con colitis inducida por DSS. El análisis de enriquecimiento de la vía del análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) y de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) reveló que la vía NF-κB se enriqueció significativamente en ratones Tmigd1INT-KO tratados con DSS (Fig. 5J, K). Como se esperaba, la fosforilación de p65 se detectó en modelos de colitis inducida por DSS y TNBS, y la fosforilación de p65 aumentó significativamente en ratones Tmigd1INT-KO en comparación con ratones WT (Fig. 5H, archivo adicional 1: Fig. S7A). Además, la sobreexpresión de TMIGD1 resultó en una menor fosforilación de p65 en extractos de células completas y una disminución de p65 en el núcleo, con una actividad atenuada de unión al ADN de la p65 nuclear. Por el contrario, la eliminación de TMIGD1 mejoró la fosforilación de p65 en extractos de células enteras, aumentó la acumulación de p65 en el núcleo y activó la actividad de unión al ADN de p65 nuclear (Fig. 5I, L, archivo adicional 1: Fig. S7B-S7C ). Sin embargo, otros marcadores de la vía NF-κB (p. ej., IKKα, IKKβ, IκBα y su fosforilación) se mantuvieron sin cambios (archivo adicional 1: Fig. S7D). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que TMIGD1 se une directamente al BANF1 citoplasmático e inhibe la vía NF-κB.
La proteína BANF1 se redujo en la mucosa colónica inflamada de pacientes con colitis inducida por CD, DSS y TNBS en comparación con los grupos de control correspondientes (Figs. 5G, H y 6A y archivo adicional 1: Fig. S7A). Para explorar el motivo de la expresión sincronizada de proteínas entre TMIGD1 y BANF1, utilizamos 50 μg/ml de cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas en células NCM460 y observamos cambios en el nivel de proteína BANF1 a lo largo del tiempo. La sobreexpresión de TMIGD1 mantuvo los niveles de proteína BANF1 al inhibir la degradación de BANF1, mientras que la eliminación de TMIGD1 condujo a una rápida degradación de BANF1. Por lo tanto, la interacción TMIGD1-BANF1 puede ayudar a mantener la expresión de BANF1 y proteger a BANF1 de la degradación (Fig. 6B).
BANF1 es crucial para que TMIGD1 mantenga la barrera epitelial intestinal y atenúe la inflamación a través de la vía NF-κB. A El nivel de expresión de la proteína BANF1 en los tejidos del colon de pacientes con EC y de individuos sanos. B Se evaluó la degradación de la proteína BANF1 en células NCM460 tratadas con 50 μg/ml de CHX. La permeabilidad C, D TEER y FD4 se midieron después de la estimulación con TNF-α en el modelo de monocapa Caco2. E, F Los niveles de expresión de las proteínas AJC, p65 y p65 fosforilada después de la estimulación con TNF-α en células NCM460. La permeabilidad G, H TEER y FD4 se midieron después de la estimulación con TNF-α en el modelo de monocapa Caco2. I, J Inmunoprecipitado por anticuerpo anti-BANF1 (I) y anticuerpo anti-p65 (J) de los lisados de células NCM460. Se utilizó lisado IP (10%) como entrada. Microscopio confocal K que muestra la colocalización de BANF1 y p65 en células NCM460. Barras de escala, 10 μm. L, M Después de la estimulación con TNF-α, expresión de p65 y BANF1 en fracciones citoplasmáticas y nucleares (izquierda), ensayo de unión del factor de transcripción de p65 nuclear (centro) y localización subcelular de p65 (derecha) en células NCM460. Barras de escala, 10 μm. Los datos se expresan como media ± SEM. **p<0,01, ***p<0,001
Además, mientras que la eliminación de TMIGD1 condujo a una disminución de TEER y un aumento de la permeabilidad de FD4 en el modelo de células monocapa Caco2, la sobreexpresión de BANF1 en las células de eliminación de TMIGD1 restableció TEER y redujo la permeabilidad de FD4 (Fig. 6C, D). La sobreexpresión de BANF1 también revirtió significativamente los niveles de expresión regulados a la baja de AJC y el aumento de la expresión de citoquinas proinflamatorias en comparación con el grupo de eliminación de TMIGD1 (Fig. 6E, archivo adicional 1: Fig. S8A, S8C y S8D). Por el contrario, después de la inhibición de BANF1, las células sobreexpresadas de TMIGD1 mostraron una función de barrera epitelial intestinal debilitada, un aumento de citocinas proinflamatorias y una disminución de los AJC (Fig. 6F-H, archivo adicional 1: Fig. S8B-S8D). Por lo tanto, BANF1 es un mediador crucial de TMIGD1 para mantener la barrera epitelial intestinal y atenuar la inflamación.
La interacción proteína-proteína entre BANF1 y p65, el principal efector de la vía NF-κB, se verificó mediante co-IP (Fig. 6I, J). Esto también fue respaldado por la colocalización de BANF1 y p65 (Fig. 6K). Después de derribar TMIGD1, los niveles de BANF1 citoplasmático disminuyeron significativamente. Sin embargo, la sobreexpresión de BANF1 causó una disminución de la fosforilación de p65 en extractos de células completas, una expresión de p65 nuclear regulada a la baja y una actividad de unión al ADN de p65 nuclear atenuada (Fig. 6E y L, archivo adicional 1: Fig. S8A y S8E). Por el contrario, la sobreexpresión de TMIGD1 reguló positivamente BANF1 citoplasmático. La fosforilación de P65 en extractos de células completas, la expresión de p65 nuclear y la actividad de unión al ADN de p65 nuclear se regularon positivamente después de eliminar BANF1 (Fig. 6F y M, archivo adicional 1: Fig. S8B y S8F). En total, TMIGD1 mantuvo la expresión proteica de BANF1. BANF1 citoplásmico capturó aún más p65, inhibió la translocación de p65 del citoplasma al núcleo y finalmente disminuyó la fosforilación de p65 (S536). En consecuencia, BANF1 es crucial para la función de TMIGD1 al inhibir la vía NF-κB.
Como una reducción en la interacción TMIGD1-BANF1 condujo a una disfunción de la barrera intestinal e inflamación mediante la activación de la vía NF-κB, exploramos más a fondo si la restauración de los niveles de TMIGD1 y BANF1 podría rescatar la inflamación y la función de la barrera mucosa. Inyectamos adenovirus (ADV) por vía intraperitoneal para aumentar la expresión de TMIGD1 y BANF1 en ratones 2 días antes de inducir colitis con DSS. Después de restaurar TMIGD1 y BANF1, los ratones WT y Tmigd1INT-KO con colitis mostraron un mayor peso corporal y longitud del colon, menos diarrea con sangre y una menor actividad de la enfermedad (Fig. 7A-C, archivo adicional 1: Fig. S9A-S9C). También mostraron recuperación histológica con epitelio de apariencia más normal y menos infiltración de linfocitos (Fig. 7D, E). Además, la reexpresión de TMIGD1 y BANF1 rescató la función de la barrera intestinal, lo que resultó en un menor flujo sérico de FD4 acompañado de una mayor expresión de AJC (Fig. 7F, G, archivo adicional 1: Fig. S9D-S9E). En la ultraestructura, la presencia de complejos de unión intracelular intactos y microvellosidades bien conservadas sin distorsión grave confirmaron los efectos terapéuticos de la suplementación con TMIGD1 y BANF1 (Fig. 7H, I). La restauración de TMIGD1 y BANF1 también inhibió la vía NF-κB, redujo la acumulación de neutrófilos y células T CD4+ y atenuó la excreción de citoquinas proinflamatorias, especialmente para las citocinas relacionadas con la vía NF-κB (Fig. 7J, K, archivo adicional 1: Fig. S9F-S9H).
La restauración de TMIGD1 y BANF1 alivia la inflamación y reanuda la función de barrera intestinal. A, B Peso corporal y longitud del colon. La punta de flecha indica el momento en el que se inyectó ADV por vía intraperitoneal para estimular la expresión de TMIGD1 y BANF1 en ratones. Cada grupo, n=5. C Imágenes representativas de dos puntos. D Puntuaciones histológicas. Cada grupo, n=5. E Imágenes representativas de HE colónico. Barras de escala, 200 μm. F La concentración de FD4 sérica. Cada grupo, n=5. G Imágenes representativas de secciones de colon teñidas con ZO-1. Barras de escala, 100 μm. H Medición de la longitud de las microvellosidades (arriba) y los espacios AJC (abajo) en células epiteliales del colon mediante TEM. Cada grupo, n=3. I Imágenes TEM representativas de la mucosa colónica. Las puntas de flecha indican AJC. Barras de escala, 500 nm. Actividad de J MPO en tejidos de colon. Cada grupo, n=5. Las concentraciones séricas de TNF-α e IL-6 se detectaron mediante multiELISA; Cada grupo, n=5. Los datos se expresan como media ± SEM. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001
TMIGD1 fue regulado negativamente por TNF-α y, a su vez, la disminución de TMIGD1 mejoró la excreción de TNF-α, lo que sugiere una estrecha relación entre TMIGD1 y TNF-α. Por lo tanto, probamos si la expresión de TMIGD1 se asociaba con la capacidad de respuesta a la terapia anti-TNF en pacientes con EC. La evidencia preliminar que respalda esta teoría se obtuvo mediante el análisis de dos conjuntos de datos de transcriptomas publicados: células mononucleares de la lámina propia (LPMC) de respondedores y no respondedores a anti-TNF (GSE111761) [27], y tejidos intestinales de la cohorte RISK (GSE134881) [28]. Encontramos que el TMIGD1 inicial estaba significativamente elevado en los respondedores anti-TNF sin tratamiento previo en ambos conjuntos de datos (Fig. 8A-D). En la cohorte RISK, la expresión inicial de TMIGD1 podría predecir la respuesta anti-TNF con una sensibilidad del 77,2 % y una especificidad del 62,5 % utilizando un modelo logístico (AUC = 0,745; IC del 95 %, 0,540–0,950; Fig. 8E). Además, incluimos retrospectivamente biopsias de pacientes que respondieron y no respondieron al anti-TNF con actividad de la enfermedad similar antes de la terapia anti-TNF (archivo adicional 1: Tabla S6). Los análisis de IHC y de transferencia Western revelaron una regulación negativa de TMIGD1 en la mucosa colónica inflamada de los que no respondieron en comparación con los que sí respondieron, antes del tratamiento anti-TNF (Fig. 8F-H). En resumen, el TMIGD1 basal era un biomarcador potencial para predecir la respuesta al tratamiento anti-TNF.
La expresión de TMIGD1 predice la respuesta al tratamiento anti-TNF. A, B Mapa de calor y diagrama de caja de GSE111761 que muestra diferentes expresiones iniciales de ARNm en LPMC de 3 pacientes con EC que respondieron a anti-TNF y 3 que no respondieron. C, D Mapa de calor y diagrama de caja del conjunto de datos GSE134881 que muestra diferentes expresiones iniciales de ARNm en tejidos intestinales de pacientes con EC que responden a anti-TNF (n=24) y que no responden (n=36). E Curva de características operativas del receptor (ROC) para la predicción de la respuesta anti-TNF con la expresión inicial del ARNm de TMIGD1 (AUC = 0,745, IC del 95 %: 0,540–0,950). F La expresión de la proteína TMIGD1 en tejidos del colon antes del tratamiento anti-TNF. G Imágenes IHC representativas de secciones teñidas con TMIGD1 de respondedores y no respondedores antes del tratamiento anti-TNF. Barras de escala, 200 μm (arriba) y 50 μm (abajo). H La intensidad de la tinción de las secciones teñidas con TMIGD1 de los que respondieron (n=10) y de los que no respondieron (n=10). La intensidad de la tinción del área positiva se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los datos se expresan como media ± SEM. *p<0,05, ***p<0,001
En el presente estudio, demostramos que TMIGD1 desempeñó un papel protector en el desarrollo de CD (archivo adicional 1: Fig. S10). El análisis de la integración multiómica demostró que TMIGD1 se asoció negativamente con las características inflamatorias de la EC. La expresión de TMIGD1 disminuyó notablemente en la mucosa colónica inflamada de pacientes con EC y en colitis de ratón. Los ratones Tmigd1INT-KO mostraron una mayor susceptibilidad a la colitis inducida por DSS y TNBS. Además, TMIGD1 inhibió la inflamación y protegió la función de la barrera intestinal en la EC. En condiciones fisiológicas, TMIGD1 interactuó directamente con BANF1 citoplasmático y mantuvo la expresión proteica de BANF1. BANF1 citoplásmico capturó aún más p65, inhibió la translocación de p65 del citoplasma al núcleo y finalmente suprimió la activación de la vía NF-κB. Sin embargo, en un entorno inflamatorio, la transcripción de TMIGD1 estaba reprimida y la TMIGD1 reducida no cumplió el papel protector antes mencionado, agravando así la inflamación y el daño de la barrera mucosa. Finalmente, la restauración de TMIGD1 ayudó a mantener la homeostasis de la mucosa intestinal. La mayor expresión de TMIGD1 predijo la capacidad de respuesta al tratamiento anti-TNF en pacientes con EC. En conclusión, TMIGD1 es un objetivo terapéutico para la EC y potencialmente guía la optimización de la terapia anti-TNF.
Durante la patogénesis de la EC, la ruptura de la barrera intestinal conduce a un aumento de la permeabilidad intestinal, invasión de patógenos y sustancias tóxicas, respuestas inmunes excesivas y respuestas inflamatorias crónicas [29, 30]. Con una estructura molecular similar a la de la subfamilia clásica de moléculas de adhesión de unión, es probable que TMIGD1 desempeñe un papel similar al de otras proteínas AJC en la integridad de la barrera intestinal [8]. En nuestro estudio, identificamos el papel antiinflamatorio de TMIGD1 basándose en la multiómica a escala poblacional. La expresión de TMIGD1 se asoció negativamente con los índices clínicos de pacientes con EC, como CDAI, PCR sérica, SES-CD y puntuación GHAS. Además, los pacientes con EC que portaban variantes genómicas de TMIGD1 mostraron niveles más altos de proteínas proinflamatorias. En el entorno inflamatorio, se suprimió la transcripción de TMIGD1. La disminución de TMIGD1, a su vez, provocó daños graves en la barrera y una mayor inflamación, formando así un círculo vicioso. Por el contrario, la restauración de los niveles de TMIGD1 alivió la inflamación y recuperó la función de barrera y la integridad intestinal.
Estudios anteriores demostraron que BANF1 era una proteína altamente conservada, ubicua y autoasociada (9KD) y funcionaba como un dímero (19KD) [31]. BANF1 tiene una distribución subcelular dinámica en el citoplasma, el nucleoplasma y el núcleo [32]. BANF1 tiene numerosas funciones debido a su capacidad para unirse tanto al ADN como a las proteínas. Lo más importante es que BANF1 protege la integridad del genoma y garantiza la finalización exitosa de la mitosis [33]. BANF1 también realiza una función antiinflamatoria. En la psoriasis, la translocación de BANF1 desde el citoplasma al núcleo suprime la fosforilación de c-Jun y mitiga la inflamación cutánea [34]. En nuestro estudio, revelamos un nuevo papel de BANF1 y lo demostramos como puente de enlace en la interacción TMIGD1-BANF1-p65 en células epiteliales intestinales. En particular, TMIGD1 se une directamente al BANF1 citoplasmático, manteniendo los niveles de BANF1 en las células epiteliales intestinales. Posteriormente, BANF1 captura p65 citoplasmática, inhibiendo la translocación de p65 del citoplasma al núcleo y disminuyendo así la fosforilación de p65 (S536). A su vez, la disminución de la fosforilación de p65 reduce la producción de citocinas relevantes para la vía NF-κB y mantiene la integridad de la barrera al promover la producción de proteína AJC. Además, descubrimos que restaurar BANF1 era esencial para que TMIGD1 mantuviera la homeostasis intestinal in vitro e in vivo. Sin embargo, se requiere más investigación para identificar los motivos de unión exactos entre TMIGD1, BANF1 y p65.
Actualmente, la terapia anti-TNF es ineficaz en una gran proporción de pacientes con EC [35]. Los biomarcadores de respuesta al tratamiento son importantes para la medicina personalizada, que optimiza la eficacia, disminuye el riesgo de eventos adversos y reduce los costos para un paciente seleccionado [36]. Sin embargo, la mayoría de los factores predictivos siguen siendo controvertidos en la práctica clínica. Nuestro estudio reveló que la regulación negativa de TMIGD1 contribuyó al circuito de retroalimentación positiva de la lesión inflamatoria inducida por TNF-α. La expresión de TMIGD1 fue reducida por el TNF-α y esta regulación negativa condujo a un TNF-α descontrolado mediante la pérdida de regulación de la vía NF-κB. Nuestro hallazgo demostró que TMIGD1 era un biomarcador prometedor porque los niveles basales reducidos de TMIGD1 en la mucosa intestinal o LPMC se asociaron con la falta de respuesta a la terapia anti-TNF (p. ej., infliximab) en pacientes con EC. Sin embargo, en el futuro deberían replicarse investigaciones similares con un tamaño de muestra mayor. También se requieren más investigaciones para revelar los mecanismos subyacentes a esta relación predictiva.
En resumen, la expresión de TMIGD1 se asocia negativamente con las características inflamatorias de la EC. TMIGD1 inhibe la inflamación y mantiene la función de la barrera intestinal al interactuar directamente con BANF1 citoplasmático y la posterior inactivación de la vía NF-κB. Nuestro estudio propone que TMIGD1 es un objetivo terapéutico prometedor para la EC y puede guiar la optimización de la terapia anti-TNF.
Todos los datos asociados con este estudio estaban presentes en el artículo o en los archivos adicionales. Nuestro conjunto de datos interno (PRJNA860352 y PRJNA859794) y los datos de cohorte publicados (la cohorte 1000IBD, GSE116222, GSE134881, GSE111761) se pueden descargar desde NCBI Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/) y el proyecto 1000IBD (https://ega-archive.org/studies/EGAS00001002702). Todos los conjuntos de datos o la información generada en este estudio están disponibles previa solicitud razonable del autor correspondiente.
Adenovirus
Complejo de unión apical
Factor de montaje nuclear BAF 1
enfermedad de Crohn
Índice de actividad de la enfermedad de Crohn
Proteína C-reactiva
Índice de actividad de la enfermedad
Sulfato de dextrano sódico
Isotiocianato de fluoresceína-dextrano de 4 kD
Puntuación de actividad histológica de Geboes
interleucina
Purificación por inmunoafinidad
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.
Puntuación endoscópica simple para la enfermedad de Crohn
Resistencia eléctrica transepitelial
Microscopio de transmisión por electrones
Proteína 1 que contiene dominio transmembrana y de inmunoglobulina
Eliminación de Tmigd1 intestinal específica
Ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico
Factor de necrosis tumoral α
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Agradecemos al Prof. Rinse K Weersma (Universidad de Groningen, Países Bajos) por proporcionar datos de la cohorte 1000IBD.
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82170534 y 81870384).
Longyuan Zhou, Liguo Zhu, Xiaomin Wu y Shixian Hu contribuyeron igualmente al trabajo.
Departamento de Gastroenterología, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guangdong, República Popular China
Longyuan Zhou, Liguo Zhu, Xiaomin Wu, Shenghong Zhang, Min Ning y Minhu Chen
Instituto de Medicina de Precisión, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guangdong, República Popular China
Shixian Hu
Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Digestivas, Instituto de Enfermedades Digestivas y Departamento de Medicina y Terapéutica, Instituto de Ciencias de la Salud Li Ka Shing, Instituto de Investigación CUHK Shenzhen, Universidad China de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China
juan yu
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MC concibió el concepto del estudio. MC y LZ1 diseñaron el estudio. LZ1, LZ2 y XW realizaron experimentos. LZ1 y SH realizaron análisis de datos y formatearon figuras y tablas. LZ1 y LZ2 escribieron el manuscrito. MC, JY, SZ y MN comentaron el estudio y revisaron el manuscrito. Todos los autores aprobaron la versión final del manuscrito.
Correspondencia a Minhu Chen.
El estudio en humanos fue aprobado por la Junta Institucional del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, y también se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes ([2022] No. 252). Todos los protocolos de experimentación con animales fueron aprobados por la Junta Institucional del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen ([2021] No. 028).
No aplica.
Los autores declararon que no tienen intereses en competencia.
Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
Tabla S1. Anticuerpos. Tabla S2. Cebadores utilizados en qPCR. Tabla S3. Características clínicas de pacientes con EC e individuos sanos en la secuenciación del transcriptoma. Tabla S4. Características clínicas de pacientes con EC e individuos sanos analizados para determinar la expresión de TMIGD1. Tabla S5. Características clínicas de pacientes con EC e individuos sanos analizados para tinción IHC de TMIGD1. Tabla S6. Características clínicas de los pacientes con EC que responden y no responden al anti-TNF antes del tratamiento anti-TNF. Figura S1. Verificación de ratones Tmigd1INT-KO. Figura S2. La colitis inducida químicamente en ratones Tmigd1INT-KO muestra una inflamación más grave. Figura S3. La colitis inducida químicamente en ratones Tmigd1INT-KO muestra una disfunción de barrera más grave. Figura S4. TMIGD1 se regula negativamente después de la estimulación con TNF-α. Figura S5. TMIGD1 modula la función de barrera y la inflamación. Figura S6. TMIGD1 se une a BANF1. Figura S7. TMIGD1 modula BANF1 e inactiva la vía NF-κB. Figura S8. BANF1 es crucial para que TMIGD1 mantenga la función de barrera e inhiba la inflamación. Figura S9. La restauración de TMIGD1 y BANF1 repara la función de barrera y atenúa la inflamación. Figura S10. El modelo propuesto para el panorama de la vía TMIGD1-BANF1-NF-κB en la EC.
Los efectos cis-eQTL de variantes genómicas cercanas a TMIGD1 en la expresión de TMIGD1 en el conjunto de datos de la cohorte 1000IBD.
La asociación entre las variantes cis-eQTL y las proteínas proinflamatorias de la EC en suero en el conjunto de datos de la cohorte 1000IBD.
Los geles o western blots originales sin recortar de las figuras.
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Reimpresiones y permisos
Zhou, L., Zhu, L., Wu, X. et al. La disminución de TMIGD1 agrava la colitis y la disfunción de la barrera intestinal a través de la vía BANF1-NF-κB en la enfermedad de Crohn. BMC Med 21, 287 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02989-2
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Recibido: 16 de enero de 2023
Aceptado: 20 de julio de 2023
Publicado: 04 de agosto de 2023
DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02989-2
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