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Dec 04, 2023

CD36 media el SARS

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 5077 (2023) Cita este artículo 899 Accesos 12 Detalles de Altmetric Metrics La coagulación aberrante y la trombosis se asocian con COVID-19 grave

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5077 (2023) Citar este artículo

899 Accesos

12 altmétrico

Detalles de métricas

La coagulación aberrante y la trombosis se asocian con una infección grave por COVID-19 posterior al SARS-CoV-2, pero el mecanismo subyacente sigue siendo oscuro. Aquí mostramos que los niveles séricos de la proteína de la envoltura (E) del SARS-CoV-2 están asociados con trastornos de la coagulación de los pacientes con COVID-19, y la administración intravenosa de la proteína E puede potenciar la trombosis en ratones. A través de la extracción de proteínas y la espectrometría de masas, encontramos que CD36, una glicoproteína transmembrana, se une directamente a la proteína E y media la hiperactivación de plaquetas humanas y de ratón a través de la vía de señalización p38 MAPK-NF-κB. Por el contrario, el bloqueo farmacológico de CD36 o p38 atenúa notablemente la activación plaquetaria humana inducida por la proteína E. De manera similar, la deficiencia genética de CD36, así como la inhibición farmacológica de p38 en ratones, disminuye significativamente la activación plaquetaria inducida por la proteína E y los eventos trombóticos. En conjunto, nuestro estudio revela un papel fundamental para el eje CD36-p38 en la hiperactividad plaquetaria inducida por la proteína E, que podría servir como un objetivo viable para desarrollar terapias contra eventos trombóticos aberrantes relacionados con la gravedad y la mortalidad de COVID-19.

La pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ha provocado una crisis sanitaria mundial1, 2. Las manifestaciones clínicas van desde el resfriado común hasta la neumonía grave y la insuficiencia multiorgánica. y muerte3. En particular, se observan con frecuencia coagulación aberrante y eventos trombóticos intensos en pacientes con COVID-19 y se informa que son complicaciones potencialmente mortales4,5,6. De hecho, los niveles elevados de dímero D y del producto de degradación de fibrina (FDP), un tiempo de protrombina (PT) más largo y un tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se observan comúnmente en pacientes graves/críticos y se asocian con una alta tasa de coagulación intravascular diseminada (CID)7 ,8,9; la trombosis de las arterias pulmonares pequeñas y medianas se considera una posible causa letal de COVID-19 en los estudios de autopsias;10 la embolia pulmonar (EP) y la trombosis venosa profunda (TVP) representan la mayoría de los eventos tromboembólicos en pacientes con COVID-19 grave/crítico. ;11 la microtrombosis local resultante de la activación de la coagulación durante el inicio de la enfermedad de COVID-19 puede provocar trastornos en los sistemas cardiovascular, respiratorio, gastrointestinal y neurológico, incluso después de la eliminación viral12,13. Además, la evidencia emergente sugiere que la trombosis también podría ser una causa principal de COVID-19 prolongado y que el riesgo de TVP y EP aumenta significativamente en pacientes después de la recuperación de COVID-1914.

De acuerdo con las anomalías trombóticas observadas, con frecuencia se detecta una mayor activación plaquetaria en COVID-19. Se sugirió que la activación plaquetaria en COVID-19 está involucrada en la trombosis inmune, que generalmente se caracteriza por respuestas inmunes aberrantes relacionadas con la trombosis de factores del complemento, citoquinas inflamatorias, inmunoglobulinas y la activación de células endoteliales15,16. Sin embargo, estudios recientes también observaron niveles elevados de dímeros D e INR en pacientes leves/moderados sin respuesta inmune anormal17, lo que implica un mecanismo alternativo de trombosis en COVID-19, como un efecto directo de la interacción viral-plaquetas. De hecho, la alteración del transcriptoma en las plaquetas post-infección por SARS-CoV-2 difiere de la de otras enfermedades virales (como el virus del dengue y el virus de la influenza), aunque la trombosis también se encuentra en estas enfermedades virales18,19. Mecánicamente, el análisis del transcriptoma de plaquetas ha demostrado un papel de la señalización MAPK en la activación de las plaquetas de COVID-1920, y se ha informado que la proteína Spike mejora la agregación plaquetaria inducida por varios agonistas in vitro, aunque todavía existe controversia sobre si las plaquetas humanas expresan enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), el receptor de la proteína Spike20,21. Investigaciones adicionales han revelado que los receptores tipo peaje 4 (TLR4), CD42b y CD147 son receptores alternativos para la proteína Spike22,23,24,25. Sin embargo, el papel del CD147 en la activación plaquetaria mediada por Spike sigue siendo controvertido ya que otros estudios no han podido observar la unión de la proteína Spike a ellas26.

La proteína de la envoltura (E) es la proteína estructural principal más pequeña, y quizás la más enigmática, del SARS-CoV-2, y comparte una secuencia altamente conservada con las proteínas E del SARS-CoV y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV27. 28. Según estudios recientes, la proteína E contribuye a la progresión de la COVID-19 además de su papel en el ensamblaje y la gemación viral. Por ejemplo, la proteína E del SARS-CoV-2 por sí sola puede causar daños similares al síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lo que induce una muerte celular rápida y una secreción intensa de citocinas29, mientras que el SARS-CoV-2 con inactivación o ausencia de la proteína E muestra una disminución. títulos y virulencia atenuada30,31. La proteína E también ha sido identificada como un factor de virulencia independiente con actividad de canal iónico32, y TLR2 puede detectarla para promover la producción de citoquinas inflamatorias antes de la entrada viral33, destacando su papel esencial en la patogénesis de COVID-19. Sin embargo, aún queda por explorar la capacidad protrombótica de la proteína E.

Aquí, mostramos la presencia de proteína E en el suero de una fracción significativa de pacientes con COVID-19 y demostramos que la proteína E potenciaba la formación de trombos in vivo en modelos murinos. In vitro, la proteína E podría interactuar directamente con CD36 en la superficie celular de las plaquetas, lo que lleva a la activación de las plaquetas a través de la vía de señalización p38-MAPK. Por último, demostramos que el efecto potenciador de la proteína E tanto sobre la activación plaquetaria como sobre la trombosis fue anulado por la mutación nula de CD36 o el bloqueo farmacológico de CD36.

Para evaluar la relación entre los niveles séricos de proteína E del SARS-CoV-2 y los eventos trombóticos en COVID-19, utilizamos un ensayo ELISA directo interno para medir la proteína E en sueros de 145 pacientes con COVID-19 en el momento de la admisión. al hospital (24 pacientes mostraron síntomas graves y 121 mostraron síntomas no graves durante la hospitalización; consulte Métodos para obtener detalles sobre la categorización de los pacientes). Si bien no se detectó ninguna traza de proteína E en los sueros de 51 donantes sanos de la misma edad y sexo (controles negativos), se detectaron niveles notables de proteína E en 31 de las 145 (21,4%) muestras de suero de COVID-19. (media: 57,7 ng/mL: rangos: 7,8-261,7 ng/mL), y los niveles de proteína E sérica fueron significativamente más altos en pacientes graves que en pacientes no graves (Fig. 1a).

a La proteína E se detectó en 31 pacientes con COVID-19. El nivel de proteína E en pacientes con COVID-19 fue de 12,33 ± 34,87 ng/ml. Los pacientes con COVID-19 se dividieron en un grupo no grave (n = 121) y un grupo grave (n = 24) como se describe en la sección "Métodos". El nivel de proteína E aumentó significativamente en el suero de pacientes con COVID-19 grave (51,43 ± 68,63 ng/ml) en comparación con los pacientes con COVID-19 no grave (4,58 ± 13,77 ng/ml). En COVID se observaron tiempos de tromboplastina parcial activada (TTPA) (b) y tiempo de protrombina (PT) (c) significativamente más largos, dímero D elevado (d) y productos de degradación del fibrinógeno (FDP) (e), y recuentos de plaquetas disminuidos (f). -19 pacientes con prueba E positiva (n = 31), en comparación con pacientes de COVID-19 con prueba E negativa (n = 114). La línea gris representa el nivel de corte. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis (a) o la prueba U de Mann-Whitney de dos colas (b-f). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Aunque ninguno de los pacientes con COVID-19 presentó trombosis al ingreso hospitalario, 12 desarrollaron eventos trombóticos, de los cuales 7 fueron COVID-19 graves y 5 no graves, durante la duración de la hospitalización (media: 18,3 días: rangos: 15- 26 días). En particular, los niveles séricos de proteína E se correlacionaron positivamente con los parámetros de diagnóstico de coagulación, como elevaciones en el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), el tiempo de protrombina (PT), el aumento del dímero D y los productos de degradación del fibrinógeno (FDP) (Fig. 1b-e y Figura complementaria 1a – d). Además, los niveles séricos de proteína E se correlacionaron negativamente con los recuentos de plaquetas (Fig. 1f y Fig. 1e complementaria), aunque hubo una correlación positiva significativa entre los niveles de CD62P en plasma, que sirve como marcador de la activación plaquetaria (Fig. 1e complementaria). .1f). El odds ratio de trombosis con niveles séricos de E fue de 1,015 (1,004–1,027) (Tabla 1), lo que sugiere que la proteína E es un indicador significativo de la trombosis de COVID-19.

Dada la presencia de proteína E en la sangre de pacientes con COVID-19, planteamos la hipótesis de que las proteínas E circulatorias podrían ser protrombóticas in vivo. Para probar esto, establecimos un modelo de embolia pulmonar en ratones, mediante el cual los trombos en los vasos pulmonares fueron inducidos por una mezcla de colágeno y epinefrina tras la administración intravenosa de la proteína E (Fig. 2a)34. Inyectamos 0,5, 1, 2 o 4 μg de proteína E por ratón en estos modelos y descubrimos que solo la dosis más alta (4 μg de proteína E por ratón) resultó en un fuerte aumento de trombos en los vasos pulmonares (Fig. 2c, d). En tales casos, la tinción por inmunofluorescencia reveló una unión elevada de la proteína E a las plaquetas, marcadas por CD41, en el sitio de los trombos de los vasos pulmonares (Fig. 2b y Fig. 2 complementaria). Estos resultados proporcionaron evidencia de que la proteína E puede causar embolia pulmonar cuando está presente por encima de un cierto nivel umbral en la sangre. Según la traducción de dosis entre animales de laboratorio y humanos en el desarrollo de fármacos35, se estima que 4 μg de proteína E por ratón equivalen a 240 ng/ml en el suero de humanos, lo que estaba dentro del rango superior de proteínas E séricas en pacientes ( 261,7 ng/ml (figura 1a).

a A ratones de tipo salvaje (WT) se les inyectó por vía intravenosa la proteína E (0,5, 1, 2 y 4 μg por ratón) o PBS. Cuatro horas más tarde, se indujeron modelos de ratón con embolia pulmonar (EP) mediante inyección intravenosa de colágeno y epinefrina. b La presencia de la proteína E en las plaquetas en la embolia pulmonar de ratones. La tinción por inmunofluorescencia en una sección de pulmón del modelo de PE de ratón tratado con E se realizó con anticuerpos anti-SARS-CoV-2 E (rojo) y anti-CD41 (verde). Los núcleos se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Barra de escala = 10 μm. c Campo representativo de secciones de pulmón teñidas con hematoxilina-eosina (HE) en cada grupo. Barra de escala = 100 μm. Los resultados en b y c se confirmaron en cinco experimentos independientes. d Cuantificación del número de embolias pulmonares por campo visual en secciones de pulmón. El número de trombos pulmonares fue de 13,72 ± 3,96 en ratones WT tratados con PBS, 13,64 ± 4,28 en ratones WT tratados con E (0,5 μg), 14,44 ± 4,51 en ratones WT tratados con E (1 μg), 16,20 ± 4,67 en E- ratones WT tratados (2 μg) y 22,00 ± 4,74 en ratones WT tratados con E (4 μg). Los datos son media ± DE de 25 recuentos de 5 ratones en cada grupo. Los ratones WT se trataron con proteína E (4 μg por ratón) o PBS, y luego se realizó el modelo de estenosis de la vena cava inferior (VCI). f Imagen representativa de los trombos aislados de IVC de ratón. g El peso del trombo fue de 8,40 ± 1,14 mg en los ratones tratados con PBS y de 13,60 ± 1,14 mg en los ratones tratados con E (n = 5). Los datos se presentan como media ± DE. h Tinción de inmunofluorescencia de la proteína E (roja), CD41 (verde), DAPI en la sección de trombos aislados del ratón tratado con E según el modelo IVC. Barra de escala = 10 μm. Los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis (d) o la prueba U de Mann-Whitney de dos colas (g). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Debido a la alta prevalencia de trombosis venosa profunda en pacientes con COVID-19 grave o críticamente enfermos6, 14, evaluamos más a fondo el efecto de la proteína E en un modelo de estenosis de la vena cava inferior (VCI) inducida por cirugía (Fig. 2e). El peso promedio del trombo en ratones inyectados con la proteína E (4 μg/ratones) aumentó significativamente en comparación con el del grupo de control de PBS (Fig. 2f, g). También se confirmó una mayor unión de la proteína E a las plaquetas mediante tinción de inmunofluorescencia en los trombos aislados de la VCI de ratones (Fig. 2h).

Para investigar el mecanismo subyacente al efecto protrombótico de la proteína E, examinamos cómo la proteína E interactuaba con plaquetas aisladas de personas sanas in vitro. Dado que anteriormente se descubrió que la proteína S promueve el fenotipo de activación plaquetaria24,25, se utilizó en estos experimentos como control positivo. Descubrimos que, al igual que la proteína S, la proteína E podría actuar de manera dependiente de la dosis para mejorar la agregación plaquetaria dependiente de ADP (Fig. 3a y Fig. Suplementaria 3a-d), la exposición a selectina P (con o sin trombina; Fig. 3b y Fig. Suplementaria 3e), unión de fibrinógeno (Fg) (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 3e), diseminación de plaquetas (Fig. 3d y Fig. Suplementaria 3f) y retracción del coágulo (Fig. 3e y Fig. Suplementaria 3g). En estos ensayos, la proteína E pareció mostrar un potencial aún mayor para potenciar la activación plaquetaria. Por ejemplo, 2 μg/ml de proteína E indujeron un aumento más significativo en la agregación plaquetaria y la exposición a selectina P que 4 μg/ml de proteína S (Fig. 3a, b). Por otro lado, cuando se incubó con células endoteliales, la proteína E no pareció causar un cambio en la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 (Figuras complementarias 4a-c), una observación que podría sugerir que la proteína E sí lo hizo. no activan notablemente las células endoteliales, aunque se requieren más estudios para abordar el impacto de la proteína E en la función de las células endoteliales.

Se incubaron plaquetas humanas lavadas de donantes sanos con la proteína E del SARS-CoV-2 (0,5, 1, 2 μg/ml) o la proteína S del SARS-CoV-2 (1, 2, 4 μg/ml) durante 5 minutos a 37 °C como paso de pretratamiento. a Se midió la agregación de plaquetas pretratadas en respuesta a ADP (10 μM) (n = 4). Tanto la proteína E como la proteína S mejoraron la agregación plaquetaria de una manera dependiente de la dosis. La proteína E mostró una mayor capacidad para mejorar la agregación plaquetaria que la proteína S. byc La proteína E promovió de forma dependiente de la dosis la exposición a la selectina P plaquetaria y la activación de la integrina αIIbβ3. La exposición a la selectina P y la unión al fibrinógeno (Fg) en plaquetas pretratadas con o sin estimulación de 0,05 U/ml de trombina se detectaron mediante citometría de flujo (n = 4). d Se permitió que las plaquetas pretratadas se extendieran sobre Fg inmovilizado a 37 °C durante 20, 40 y 60 min. Se cuantificó el área (números de píxeles) de 3 campos aleatorios de plaquetas en expansión (n = 4). e La concentración de proteína E aceleró la retracción del coágulo. Las plaquetas pretratadas se agregaron al plasma libre de plaquetas y luego se indujo la retracción del coágulo con 1 U/ml de trombina (n = 4). Cuantificación de la retracción del coágulo a los 20, 40 y 60 min, respectivamente. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (a – c) o ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (d y e). Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar los factores intracelulares que median la activación plaquetaria inducida por la proteína E del SARS-CoV-2, utilizamos plaquetas tratadas con proteína E o PBS para experimentos de RNA-seq. El análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) reveló que muchos genes asociados con la activación plaquetaria estaban regulados positivamente por la proteína E, por ejemplo, SELP, ITGA2B, ITGB3 y CD36 (Fig. 4a). El análisis de ontología genética (GO) confirmó que los genes regulados positivamente por la proteína E estaban de hecho asociados significativamente con procesos biológicos (BP), como la activación, agregación y desgranulación de plaquetas (Fig. 4b).

a Se incubaron plaquetas humanas lavadas aisladas de donantes sanos con o sin proteína E (2 μg/ml) a 37 °C y luego se aisló el ARN de plaquetas para RNA-Seq (n = 3). Mapa de calor de transcripciones de plaquetas expresadas de manera significativamente diferencial de plaquetas humanas tratadas con o sin proteína E. b El análisis de ontología genética (GO) identificó vías enriquecidas (Log2FC ≥ 1, P ajustado <0,05). c – e Se preincubaron plaquetas humanas con la proteína E (2 μg/ml) o la proteína S (4 μg/ml) durante 5 minutos a 37 °C y se estimularon con o sin ADP (10 μM). El análisis de transferencia Western mostró que la proteína E potenciaba la fosforilación de p38 y NF-κB en plaquetas (n = 5). Las plaquetas humanas lavadas se trataron previamente con SB203580 10 µM (un inhibidor de p38) o dimetilsulfóxido (DMSO) durante 10 minutos a 37 °C, seguido de incubación con la proteína E (0,5, 1, 2 µg/ml) durante 5 minutos como paso de pretratamiento. f SB203580 suprimió la agregación plaquetaria potenciada inducida por la proteína E combinada con ADP 10 μM (n = 4). g y h SB203580 suprimió la exposición mejorada a la selectina P y la unión al fibrinógeno (Fg) de las plaquetas inducida por la proteína E (n = 4). i SB203580 inhibió la proteína E que promueve la propagación de plaquetas humanas en Fg (n = 4). Se permitió que las plaquetas pretratadas se extendieran sobre una superficie recubierta con Fg a 37 °C durante 1 h. Los datos se mostraron con análisis de cuantificación de las áreas de plaquetas en expansión (números de píxeles). j SB203580 atenuó la retracción acelerada del coágulo inducida por la proteína E en respuesta a la trombina (n = 4). Los datos se presentaron con análisis de cuantificación de la retracción del coágulo a los 20, 40 y 60 min. Análisis de transferencia Western k – m de la fosforilación de p38 y NF-κB en plaquetas. SB203580 (10 μM) suprimió los niveles elevados de fosforilación de p38 y NF-κB promovidos por la proteína E (2 μg/ml) en respuesta al ADP (10 μM) (n = 4). Los marcadores de peso molecular se muestran (c, k). Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (d – i, l, m) o ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (j). Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Según el análisis GO, los genes regulados positivamente por la proteína E también se asociaron con las vías de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y NF-κB (Fig. 4b), dos vías que previamente se había sugerido que estaban activadas en COVID-19. pacientes para mediar la producción de citocinas e impulsar la inflamación20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37. Aunque se sabía que estas vías estaban mediadas por una cascada de señalización que involucraba varias proteínas quinasas, incluida la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), la quinasa terminal c-Jun (JNK) y el grupo p38 de proteínas quinasas (p38 MAPK)38, descubrió que el tratamiento con proteína E no parecía afectar la fosforilación de ERK o JNK (Figuras complementarias 5a-c), mientras que promovía significativamente la fosforilación de p38 y NF-κB en plaquetas tras la estimulación con dosis bajas de ADP (Figura 4c). -mi). Incluso en ausencia de ADP, se observó un aumento notable en los niveles fosforilados de p38 en las plaquetas después del tratamiento con proteína E (Fig. 4c, d). De acuerdo con estudios previos, las plaquetas COVID-19 exhibieron una mayor reactividad, caracterizada por una mayor capacidad de agregación bajo estimulación con ADP (Figuras complementarias 6a, b), exposición elevada a P-selectina (Figura complementaria 6c), aumento del área de extensión en Fg inmovilizado ( Figura complementaria 6d, e) y contracción mejorada del coágulo (Figura complementaria 6f, g). Es de destacar que tanto la expresión de la proteína CD36 como la fosforilación de p38 MAPK y NF-κB aumentaron significativamente en las plaquetas de COVID-19 con o sin la presencia de agonistas (Figuras complementarias 6h-k).

Para probar si la vía p38 MAPK estaba realmente involucrada en la activación plaquetaria inducida por la proteína E, tratamos las plaquetas tanto con SB203580 (un inhibidor de p38) como con proteína E. El resultado mostró que SB203580 bloqueó significativamente la agregación plaquetaria inducida por la proteína E tras la estimulación con ADP, y este efecto fue más evidente cuando las plaquetas se trataron con una concentración más baja de proteína E (Fig. 4f y Fig. Suplementaria 7a). Asimismo, SB203580 suprimió una variedad de fenotipos de activación plaquetaria inducidos por la proteína E, incluida la exposición a selectina P (Fig. 4g), unión a Fg (Fig. 4h), diseminación de plaquetas en Fg (Fig. 4i y Fig. Suplementaria 7b), coágulo. retracción (Fig. 4j y Fig. Suplementaria 7c) y fosforilación de p38 y NF-κB (Fig. 4k – m). En conjunto, estos resultados indicaron que la vía p38 MAPK mediaba la activación plaquetaria potenciada por la proteína E.

La activación plaquetaria normalmente se inicia después de la unión de agonistas solubles o moléculas de adhesión a ciertos receptores de las plaquetas, que luego transducen las vías de señalización intracelular39. En un intento de detectar los factores que podrían interactuar con la proteína E y transducir señales de activación plaquetaria en las plaquetas, incubamos lisados ​​de plaquetas humanas con proteína E marcada con His inmovilizada en la resina de cobalto HisPur y luego sometimos las proteínas extraídas para determinar su masa. análisis de espectrometría. Una proteína de membrana notable derribada por la proteína E fue la CD36 (Tabla complementaria 2), una glicoproteína que se ha implicado en la mediación de la activación plaquetaria y la trombosis en condiciones de hiperlipidemia o inflamación40,41. En un experimento de resonancia de plasmón superficial, se confirmó aún más la interacción proteína-proteína entre la proteína E y el CD36 humano recombinante, y la afinidad se midió utilizando el método de cinética paralela. Los resultados mostraron una alta afinidad entre estas dos proteínas (KD = 55 nM, Fig. 5a). Además, confirmamos que la proteína E podría interactuar directamente con CD36 repitiendo el ensayo desplegable usando proteína E marcada con His y un CD36 recombinante (Fig. 5b), así como experimentos de co-inmunoprecipitación con el CD36 recombinante seguido de inmunotransferencia con anti -Anticuerpo de proteína E (Fig. 5c). Un ensayo ELISA en fase sólida mostró además que la proteína E (10–1000 ng / ml) se unía de manera dependiente de la dosis con CD36 inmovilizado (Fig. 5d). Consistentemente, se identificó la colocalización de la proteína E y CD36 en plaquetas aisladas de pacientes con COVID-19 (Figura complementaria 8).

a Sensorgramas Biacore y cinética de unión determinada por SPR para la proteína E recombinante del SARS-CoV-2 con la proteína CD36 humana recombinante. b Su ensayo desplegable mostró que su proteína E marcada podía derribar específicamente el CD36 recombinante. c La coinmunoprecipitación mostró que el CD36 recombinante coinmunoprecipitaba con la proteína E. Los resultados en (byc) se confirmaron en tres experimentos independientes. d La proteína E se une al CD36 inmovilizado de forma dosis dependiente. e FA6-152 (10 μg/ml) mejoró la agregación plaquetaria mejorada inducida por la proteína E (n = 4). f y g La exposición potenciada a la selectina P y la unión al fibrinógeno (Fg) de las plaquetas inducida por la proteína E disminuyeron con FA6-152 (n = 4). La exposición a la selectina P y la unión de Fg a las plaquetas se midieron con o sin estimulación de trombina (0,05 U/ml). h FA6-152 suprimió la propagación de plaquetas humanas mejoradas con proteína E en Fg (n = 4). Se permitió que las plaquetas se extendieran sobre Fg inmovilizado a 37 °C durante 1 h. Se cuantificaron las áreas (números de píxeles) de 3 campos aleatorios de plaquetas en expansión (n = 4). i La retracción acelerada del coágulo en respuesta a la trombina promovida por la proteína E fue abolida por FA6-152 (n = 4). Cuantificación de la retracción del coágulo a los 20, 40 y 60 min. El análisis de transferencia Western j-l mostró que FA6-152 (10 μg/ml) disminuyó el aumento de la fosforilación de p38 y NF-κB promovido por la proteína E (2 μg/ml) en respuesta al ADP (10 μM) (n = 4 ). Los marcadores de peso molecular se muestran (b, c, j). Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (e – h, k, l) o ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (i). Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, utilizamos FA6-152, un anticuerpo anti-CD36 humano, para bloquear CD36 en experimentos de activación plaquetaria. En particular, el tratamiento con FA6-152 atenuó la capacidad de la proteína E para promover la agregación plaquetaria (Fig. 5e y Fig. complementaria 9a). El anticuerpo anti-CD36 también disminuyó el efecto de la secreción de gránulos α de plaquetas inducida por la proteína E (Fig. 5f), la unión de Fg (Fig. 5g), la diseminación de plaquetas en Fg inmovilizado (Fig. 5h y Fig. Suplementaria 9b). retracción del coágulo (Fig. 5i; Fig. complementaria 9c), así como elevación inducida por la proteína E de los niveles de fosforilación de p38 y NF-κB (Fig. 5j-l). Por lo tanto, CD36 participó en la activación de la vía p38 MAPK/NF-κB inducida por la proteína E y en la activación plaquetaria.

El hallazgo anterior de que la proteína E viral podría actuar a través de CD36 para potenciar la activación plaquetaria sugirió a esta última como un objetivo candidato para la intervención terapéutica para reducir el riesgo de trombosis en COVID-19. Para evaluar esta posibilidad, utilizamos el modelo de ratón de embolia pulmonar antes mencionado para comparar el efecto de la administración intravenosa de 4 μg de proteína E en ratones CD36-/- o WT (Fig. 6a; la inyección de PBS se usó como control en ambos genes). antecedentes). Primero confirmamos que los recuentos de plaquetas periféricas en ratones con deficiencia de CD36 no cambiaron significativamente en comparación con los ratones WT (Figura complementaria 10a) y reproducimos el efecto protrombótico de la proteína E en ratones WT (compárense las Figuras 6 y 2). . Pero a diferencia de lo que se observó en los animales WT, el número de trombos de la vasculatura pulmonar fue casi idéntico entre los ratones CD36 -/- a los que se les administró proteína E y PBS (Fig. 6b, c). De manera similar, cuando se indujo trombosis venosa profunda en el modelo de ratón IVC después de la administración de proteína E, el peso promedio del trombo resultante en ratones CD36 -/- disminuyó significativamente en comparación con el de los ratones WT (Fig. 6d, e). La disminución en el peso del trombo en el modelo IVC también se observó cuando se administró el inhibidor de p38 SB203580 a ratones WT inyectados con proteína E (Fig. 6f, g).

a Niveles de CD36 en plaquetas de ratón de tipo salvaje (WT) y CD36-/-. Los resultados se confirmaron en tres experimentos independientes utilizando plaquetas de diferentes ratones. A los ratones byc WT y CD36 -/- se les inyectó por vía intravenosa la proteína E (4 μg por ratón) o PBS 4 h antes del modelo de embolia pulmonar (PE). b Cuantificación del número de embolias pulmonares por campo visual en secciones de pulmón. Los datos son media ± DE de 25 recuentos de 5 ratones en cada grupo. c Campo representativo en secciones de pulmón mediante tinción con hematoxilina-eosina (HE) de ratones WT y CD36-/- inyectados con la proteína E o PBS. Barra de escala = 100 μm. d y e El modelo de estenosis de la vena cava inferior (VCI) se realizó en ratones WT y CD36 -/-. Los ratones WT y CD36-/- se trataron previamente con proteína E (4 μg por ratón) o PBS. d Imagen representativa de los trombos de la VCI. e El análisis de cuantificación del peso de los trombos (n = 5). A ratones fyg WT se les inyectó por vía intraperitoneal 10 mg/kg de SB203580 o DMSO. Después de 2 h, a los ratones se les infundió por vía intravenosa la proteína E (4 μg por ratón) o PBS, y luego se aplicaron los modelos IVC (n = 5). h La agregación potenciada por la proteína E se atenuó en plaquetas de ratones CD36-/- en respuesta al ADP (n = 4). Se incubaron plaquetas de ratones WT y CD36-/- con la proteína E o PBS durante 5 minutos a 37 °C, seguido de estimulación con ADP. i Los efectos promotores de la proteína E sobre la diseminación plaquetaria fueron abolidos en las plaquetas de ratón CD36-/- (n = 4). Los datos se mostraron con análisis de cuantificación de las áreas de plaquetas en expansión (números de píxeles) a los 20, 40 y 60 minutos. j La retracción potenciada del coágulo inducida por la proteína E se suprimió en plaquetas de ratón CD36-/- (n = 4). k – m Los niveles de fosforilación de p38 y NF-κB disminuyeron en las plaquetas de ratón CD36 -/- tratadas con E inducidas por ADP en comparación con las plaquetas de ratón WT tratadas con E (n = 4). Los marcadores de peso molecular se muestran (k). Los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis (b, e, g) o ANOVA de 2 vías con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (h-j, l, m). Los datos se presentan como media ± DE (b, e, g) o media ± SEM (h – j, l, m). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego, aislamos plaquetas de ratones WT o CD36-/- y examinamos las características normalmente asociadas con la activación plaquetaria. Los resultados mostraron que la deficiencia de CD36 eliminó varios fenotipos de activación plaquetaria inducidos por la proteína E, incluida la agregación plaquetaria en respuesta al ADP (Fig. 6h y Fig. Suplementaria 10b, e, f), la diseminación de plaquetas en Fg inmovilizado (Fig. 6i y Fig. Suplementaria). . 10c), retracción del coágulo (Fig. 6j y Fig. 10d complementaria) y aumento de la fosforilación de p38 y NF-κB (Fig. 6k-m). Por lo tanto, la deficiencia de CD36 protegió ampliamente a los ratones del fenotipo de trombosis inducido por la proteína E.

Aquí hemos proporcionado múltiples líneas de evidencia para indicar un papel de CD36 en el estado protrombótico inducido por la proteína E del SARS-CoV-2 que potencialmente subyace a los trastornos de la coagulación y la trombosis. Nuestro estudio se basa en: (1) resonancia de plasmón superficial, extracción de proteínas, coinmunoprecipitación, espectrometría de masas y ensayo ELISA en fase sólida para identificar y validar la interacción entre la proteína E y CD36; (2) ensayo de activación plaquetaria in vitro utilizando plaquetas humanas y de ratón incubadas con proteína E recombinante para demostrar el efecto de la proteína E que induce fenotipos de hiperactividad plaquetaria; (3) modelos de ratón in vivo de embolia pulmonar y estenosis de VCI bajo la condición de deficiencia de CD36 e inhibición farmacológica del anticuerpo anti-CD36 (FA6-152) o inhibidor de p38 (SB203580) para demostrar CD36 y p38 en el estado protrombótico de plaquetas y formando trombosis arterial y venosa in vivo. En conjunto, estos experimentos apuntan a un modelo mediante el cual la proteína viral E, presumiblemente como parte de los viriones circulatorios en la sangre, se une directamente al CD36 en la membrana plaquetaria, lo que conduce a la activación de la vía intracelular p38 MAPK/NF-κB y luego promueve activación plaquetaria.

Es de destacar que estudios previos han demostrado que la proteína E, tanto como proteína soluble recombinante como proteína de membrana nativa asociada con partículas virales del SARS-CoV-2, puede interactuar físicamente con el receptor transmembrana TLR2 de una manera específica y dependiente de la dosis. , y la interacción E-TLR2 puede estimular el factor de transcripción NF-κB y la producción de la quimiocina inflamatoria CXCL8 en células que sobreexpresan TLR2 (p. ej., línea celular HEK-TLR2)33,37. Además, la proteína S viral puede unirse de forma independiente a CD42b, otra proteína de membrana, para estimular las plaquetas. En estos contextos, nuestro hallazgo de que CD36 es un receptor de la proteína E sugiere que el SARS-CoV-2 puede interactuar y activar las plaquetas a través de múltiples rutas (es decir, a través de S-CD42b y E-CD36) en la superficie de las plaquetas, por lo que que el virión puede provocar una anomalía sistémica del sistema de homeostasis del huésped sin entrar en las plaquetas. Curiosamente, nuestro estudio indica que la deficiencia o el bloqueo de CD36 por sí solo es suficiente para abolir la activación plaquetaria inducida por la proteína E, lo que sugiere que las actividades de unión (es decir, S-CD42b y E-CD36) fueron sinérgicas, en lugar de redundantes. Sin embargo, se necesitan más estudios bioquímicos y/o estructurales para iluminar la interacción mutua entre el virión y las plaquetas.

Hasta ahora, se han observado una variedad de otras anomalías patológicas en casos críticos o fatales, incluida la disfunción endotelial42 y la formación de NET43, que podrían verse potenciadas por la hiperactividad plaquetaria como consecuencia de la agregación de plaquetas a células endoteliales y neutrófilos20. Por lo tanto, la activación de plaquetas inducida por la proteína E a la proteína E viral puede ser parte de múltiples respuestas de células inmunes, ya sea en secuencia o en paralelo, a la infección por SARS-CoV-2. Anteriormente, se había sugerido la proteína E como un factor de virulencia para activar los monocitos para inducir una tormenta de citoquinas33. En el futuro, sería interesante investigar cómo participa la señalización CD36 en esta serie de respuestas inmunes. Además, los estudios han demostrado que los pacientes con COVID-19 pueden experimentar cambios en los niveles de lípidos en sangre, incluidos niveles elevados de triglicéridos y colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C)44,45, y el metabolismo desregulado de los lípidos plaquetarios desempeña un papel en la aparición de Complicaciones trombóticas en COVID-1946. Teniendo en cuenta que CD36 es una molécula receptora clave implicada en la regulación celular del flujo de lípidos, se justifican estudios futuros para explorar el papel de la proteína E en la regulación del metabolismo de los lípidos plaquetarios38,40.

En conclusión, nuestro estudio ilustró un mecanismo por el cual la proteína E del SARS-CoV-2 podría mejorar directamente la activación plaquetaria y la trombosis a través de un eje de señalización CD36/p38 MAPK/NF-κB. Dado que la COVID-19 es un factor de riesgo de trombosis y todavía es necesaria una tromboprofilaxis adecuada para evitar eventos trombóticos14, nuestro estudio abre una vía potencial para contrarrestar terapéuticamente las complicaciones trombóticas de la COVID-19. Teniendo en cuenta que la proteína E está relativamente conservada entre los coronavirus altamente patológicos28,47, apuntar a la ruta de los eventos trombóticos inducidos por la proteína E puede proporcionar un medio generalmente aplicable para mejorar la patogénesis de la trombosis posterior a la infección por coronavirus.

Se reclutaron ciento cuarenta y cinco pacientes con COVID-19 de la sala de aislamiento del Hospital Ruijin (Shanghai, China) entre el 18 de abril y el 31 de mayo de 2022. Se inscribieron como controles cincuenta y un donantes sanos de edad y sexo compatibles. Todos los pacientes con COVID-19 cumplieron los criterios de diagnóstico de COVID-19 y la infección por SARS-CoV-2 se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Los síntomas de COVID-19 se diagnosticaron como leves (síntomas similares a los de la gripe común sin neumonía), moderados (neumonía leve), graves (frecuencia respiratoria ≥30/min, saturación de oxígeno en sangre <93% en reposo, relación entre la presión parcial de oxígeno arterial y fracción de oxígeno inspirado [PaO2/FiO2] <300, y/o inflamación pulmonar que progresa >50% en 24 a 48 h), o crítica (insuficiencia respiratoria, shock séptico y/o disfunción multiorgánica)7. Posteriormente, los pacientes con síntomas leves o moderados se clasificaron en el grupo no grave y los que presentaban síntomas graves o críticos en el grupo grave. Las características de todos los participantes se resumieron en la Tabla complementaria 1. Se recolectaron muestras de sangre de pacientes con COVID-19 en el momento del ingreso hospitalario o de donantes sanos. Después de la centrifugación de la sangre coagulada, el suero se separó y se mantuvo congelado hasta su uso. Inscribimos una cohorte de 91 pacientes con COVID-19, todos los cuales no habían recibido tratamiento con medicamentos antiplaquetarios en el mes anterior a la inscripción. Obtuvimos muestras de suero para evaluar los niveles de proteína E y muestras de plasma para medir los niveles de CD62P. Todos los participantes en este estudio eran asiáticos. En este estudio, el sexo no se incluyó como variable en el diseño y análisis del estudio debido a la ausencia de evidencia concluyente que sugiera un sesgo sexual en la infección por COVID-19 en el momento del estudio. Como resultado, los investigadores eligieron un enfoque de inscripción consecutiva y no realizaron selección de sexo al inscribir tanto a pacientes con COVID-19 como a controles sanos. Dado que el sexo no fue una variable objetivo en el estudio, los datos relacionados con las diferencias específicas de sexo no se recopilaron ni analizaron por separado. Todos los participantes fueron reclutados según protocolos de estudio aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Ruijin (ID: 2022-71), Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Se realizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) interno para medir los niveles séricos de la proteína E del SARS-CoV-2. Brevemente, la proteína estándar (proteína E recombinante del SARS-CoV-2, n.º RP01263, ABclonal Technology) en una concentración inicial de 2000 ng/ml se diluyó al doble en serie en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % para construir un sistema de siete puntos. curva estándar. Se recubrieron placas de 96 pocillos (Costar) con proteína o suero estándar de pacientes o donantes sanos durante la noche a temperatura ambiente (RT). Después de lavar con tampón de lavado (PBS con Tween 20 al 0,05%) tres veces, se añadió un tampón de bloqueo (PBS con BSA al 5%) a los pocillos durante 2 h a temperatura ambiente. Luego se lavaron las placas tres veces. Se diluyó el anticuerpo de envoltura anti-SARS-CoV-2 de conejo (4 µg/ml, n.º NBP3-07959, Novus biológicas) en tampón de bloqueo y se añadió a cada pocillo durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces, se incubaron en la placa anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-conejo de cabra diluidos (1:1000, n.° 7074S, tecnología de señalización celular) en la placa durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron para eliminar los anticuerpos no unidos y se hicieron reaccionar con el sustrato de peroxidasa TMB durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo medio volumen de ácido sulfúrico 1,0 M. La densidad óptica se midió a 450 nm con un espectrofotómetro. Las concentraciones de proteína E de sueros de control sanos o de pacientes se determinaron comparándolas con la curva estándar. Los datos fueron recopilados mediante el software Gen5 CHS (versión 2.09).

Los niveles de CD62P soluble se midieron en plasma de pacientes con COVID-19 utilizando el kit ELISA comercial (#DY137, R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La desactivación de CD36 (CD36-/-) en el fondo genético C57BL/6 y los ratones de control C57BL/6 (machos y hembras, 6 a 8 semanas, 20 a 25 g) se adquirieron de Cyagen Bioscience, Inc.. Se realizaron todos los procedimientos con animales. de acuerdo y aprobado por la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai. En este estudio, todas las prácticas de manejo, bienestar, monitoreo y eutanasia de los animales se realizaron en estricto cumplimiento de las pautas éticas. Más específicamente, los ratones se alojaron en un ambiente libre de patógenos específico en ciclos de luz/oscuridad de 12 h con libre acceso a alimentos y agua, temperatura ambiente de 22 a 24 °C y humedad de 50 a 70%. Los ratones fueron manipulados mediante túneles o con la mano abierta en lugar de ser recogidos por la cola, con el objetivo de minimizar el estrés y promover su bienestar. Los animales fueron monitoreados periódicamente por personal calificado para garantizar su salud y bienestar. De ser necesario, la eutanasia se realizó mediante inhalación de CO2, siguiendo protocolos aprobados. Todos los experimentos con animales se realizaron de forma aleatoria y ciega. En este estudio que involucra un experimento con ratones, se omitió la consideración del sexo como una variable en el diseño y análisis del estudio debido a la disponibilidad limitada de evidencia que sugiere diferencias basadas en el sexo en la patogénesis de COVID-19 en ratones. Como resultado, presentamos los datos de forma agregada por sexo. Los valores medidos fueron excluidos en caso de fallo técnico durante el experimento. Se utilizaron al menos cinco ratones para cada grupo experimental. El número de ratones para cada experimento se muestra en la Figura respectiva.

Se recogió sangre humana de la vena antecubital en un tubo de extracción de sangre que contenía citrato de sodio tamponado. Las plaquetas lavadas se separaron del plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación a 1000 × g durante 10 minutos y se resuspendieron en tampón Tyrode. Las plaquetas de ratón se aislaron como se describió anteriormente48,49. Las plaquetas lavadas se ajustaron a aproximadamente 3 x 108 plaquetas por microlitro. Las plaquetas se incubaron con proteína E del SARS-CoV-2 (n.° RP01263, tecnología ABclonal) o proteína S (n.° RP01283LQ, tecnología ABclonal) durante 5 minutos a 37 °C antes de comenzar cada ensayo funcional. Se incubaron inhibidores de P38 (SB203580, Selleck Chemicals) o anticuerpos anti-CD36 (10 µg/ml, FA6-152, #ab17044, Abcam) con plaquetas durante 10 minutos antes de tratarlos con la proteína E. La agregación de plaquetas en respuesta al ADP se midió en un lumiagregómetro (Chrono-Log, Havertown, PA) en condiciones de agitación (900 rpm) a 37 °C. Los datos se registraron utilizando el software Aggrolink (ChronoLog, EE. UU.).

El análisis de la dispersión plaquetaria se procesó como se describe50. Después de la preincubación, se permitió que las plaquetas se adhirieran al fibrinógeno inmovilizado (20 μg/ml) en portaobjetos de vidrio durante 20, 40 o 60 min a 37 °C. Las plaquetas en expansión se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con faloidina conjugada con rodamina y se capturaron con un microscopio Zeiss. El área de plaquetas se cuantificó utilizando el software Image J (v2.9.0, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD).

Las plaquetas lavadas ajustadas a aproximadamente 3 × 108 plaquetas se sometieron a preincubación, mezclando 100 µl de plaquetas con 300 µl de plasma humano pobre en plaquetas (PPP). La retracción del coágulo se indujo mediante estimulación de trombina (1 U/ml) a 37 °C y se controló tomando fotografías en los momentos indicados (20, 40 o 60 min).

Para el ensayo de unión a fibrinógeno (Fg) y exposición a selectina P, se incubaron plaquetas pretratadas con anticuerpos anti-CD62P conjugados con PE (1:100, clon AK-4, n.º 555524, Becton Dickinson Biosciences) y Fg conjugado con AF647 (1:50). , #F35200, Life Technologies) durante 20 min a temperatura ambiente y medido con un citómetro de flujo (FACS CantoII, Becton Dickinson). Para determinar la pureza de las plaquetas, se incubaron plaquetas humanas lavadas con anticuerpos anti-CD41 conjugados con APC (1:100, clon HIP8, n.° 559777, Becton Dickinson Biosciences) y anticuerpos anti-CD45 conjugados con FITC (1:100, clon HI30( RUO), #555482, Becton Dickinson Biosciences) durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de la medición. La recopilación de datos se realizó mediante el software BD FACSDiva (versión 8.0.1).

Las plaquetas aisladas de voluntarios sanos se incubaron con o sin proteína E del SARS-CoV-2 a 37 °C. El ARN de plaquetas se extrajo utilizando el miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se calificó y cuantificó utilizando un bioanalizador Nano Drop y Agilent 2100 (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.). La secuenciación de ARN se realizó en la plataforma BGISEQ500 (BGI-Shenzhen, China) y las lecturas de secuenciación se filtraron con SOAPnuke (v1.5.2). Las lecturas limpias se asignaron al genoma de referencia (versión del genoma n.º GCF_000001405.39_GRCh38.p13) utilizando HISAT2 (v2.0.4). El análisis de genes de expresión diferencial (DEG) se llevó a cabo mediante DESeq2 (v1.4.5) con log2foldchange (log2FC)> 1,0 y valor de P ajustado <0,05. Los análisis de enriquecimiento de GO se realizaron en línea en //www.geneontology.org/.

Su ensayo desplegable se realizó utilizando el kit desplegable de interacción de proteínas PierceTM His (#21277, Thermo ScientificTM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones menores51. Brevemente, se preparó lisado de proteínas a partir de plaquetas aisladas de voluntarios sanos. La proteína E del SARS-CoV-2 marcada con His se incubó con resina de cobalto HisPur durante 1 h a 4 °C. Después del lavado, el lisado de plaquetas se añadió a la resina que contenía la proteína E marcada con His inmovilizada y se incubó a 4 °C durante 2 h, después de lo cual se eluyó el complejo de unión. Las muestras de elución se sometieron a SDS-PAGE para inmunotransferencia o espectrometría de masas (MS).

Se cortaron trozos de gel de geles SDS-PAGE y se quitaron la tinción. Posteriormente, los trozos de gel se deshidrataron utilizando una centrífuga al vacío. Las proteínas dentro del gel se sometieron a reducción, seguida de alquilación. A continuación, los trozos de gel se sometieron a digestión durante la noche con tripsina a una concentración de 12,5 ng/μl. Los péptidos resultantes se extrajeron usando ACN al 60 % con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. Los extractos se reunieron y luego se secaron completamente usando una centrífuga de vacío. La mezcla de péptidos se analizó con una columna analítica de fase reversa C18 (columna Thermo ScientificTM EASY, 10 cm de largo, 75 μm de diámetro interior, 3 μm de resina) y un espectrómetro de masas Q Exactive que se acopló a Easy nLc (Thermo ScientificTM). Los datos de MS se adquirieron utilizando un método de los 20 principales dependiente de los datos, seleccionando abundantes iones precursores del escaneo del estudio (300–1800 m/z) para la fragmentación de HCD. Los parámetros incluían un objetivo de AGC de 1e6, un tiempo máximo de inyección de 50 ms y un rango de escaneo. Se aplicó una exclusión dinámica de 30,0 s. Los archivos iniciales se procesaron seguido de una selección de la base de datos con el motor MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.2). Para la identificación de proteínas, se utilizaron las siguientes opciones. Enzima = tripsina, escisión perdida = 2, modificación fija: carbamidometilo (C), modificaciones dinámicas: oxidación (M), acetilo (K) (proteína N-término). La digestión en gel, el análisis de MS y la búsqueda en bases de datos fueron realizados por Shanghai Applied Protein Technology Company (Shanghai, China)52.

Los datos de las proteínas de membrana se buscaron en la base de datos del proteoma de referencia humana UniprotKB (http://www.uniprot.org/, actualizada al 10 de diciembre de 2021), y los resultados de la búsqueda se filtraron por péptidos ≥ 2 (Suplementario Tabla 2).

Para confirmar que la proteína CD36 es la proteína de unión en el complejo derribado por la proteína E marcada con His, se incubó la proteína CD36 humana recombinante (10 μg, #CP94, Novoprotein) con la resina que contenía la proteína E etiquetada con His inmovilizada (10 μg , #RP01263, ABclonal Technology) durante 2 h a 4 °C y luego se eluyó. Las muestras de elución se analizaron mediante SDS-PAGE y la presencia de CD36 se verificó mediante inmunotransferencia.

Los experimentos de SPR se realizaron en el instrumento Biacore 8K (GE Healthcare) a 25 °C utilizando tampón PBS-P diluido (n.º 273923, Cytiva). La proteína E recombinante del SARS-CoV-2 marcada con His se capturó en chips NTA (60 s, 10 µl/min, 30 µg/ml). Se inyectaron diluciones en serie de proteína CD36 humana recombinante, en concentraciones que oscilaban entre 400 nM y 12,5 nM para experimentos cinéticos paralelos. La superficie se regeneró en EDTA 350 mM (60 s, 30 µl/min). Las curvas con sustrato de referencia se ajustaron a un modelo de unión 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore Insight (v3.0.12).

La proteína E del SARS-CoV-2 y las mezclas de proteína CD36 humana recombinante se trataron previamente con perlas de proteína G-agarosa durante 1 hora a 4 °C. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se incubaron con anticuerpos anti-CD36 (10 µg/mL, FA6-152, #ab17044, Abcam) o isotipo IgG (10 µg/mL, clon G3A1, #5415, Cell Signaling Technology) durante 2 h. y luego se incubaron con perlas de proteína G-agarosa durante la noche en un balancín a 4 °C. Luego se recogieron las perlas y se enjuagaron 3 veces con tampón de lisis RIPA débil. La proteína E capturada en perlas o CD36 se detectó mediante inmunotransferencia.

Las plaquetas en reposo o las plaquetas agregadas se agregaron al mismo volumen de tampón de lisis que contenía una mezcla de inhibidor de proteasa al 1% (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). A continuación, las muestras se incubaron en hielo durante 20 min. Se separaron cantidades equivalentes de muestras mediante SDS-PAGE y la expresión de proteínas se cuantificó mediante transferencia Western con anticuerpos específicos53. Anti-fosfo-p38 (1:1000, clon D3F9, #4511, CST), anti-p38 (1:1000, clon D13E1, #8690, CST), anti-fosfo-NF-κB p65 (1:1000, clon 93H1, #3033, CST), anti-NF-κB p65 (1:1000, clon D14E12, #8242, CST), anti-fosfo-ERK (1:1000, clon D13.14.4E, #4370, CST), anti-ERK (1:1000, clon 137F5, #4695, CST), anti-fosfo-JNK (1:1000, clon 81E11, #4668, CST), anti-JNK (1:1000, clon 56G8, #9258, CST), anti-ICAM-1 (1:1000, #4915, CST), anti-VCAM-1 (1:1000, clon E1E8X, #13662, CST), anti-CD36 humano (1 µg/mL, #MAB1955 , R&D Systems), anti-CD36 de ratón (1 µg/mL, SMφ, #sc-7309, Santa Cruz), anti-His-Tag (1:2000, clon AMC0149, #AE003, ABclonal Technology), anti-IgG humana Como anticuerpos primarios se utilizaron anticuerpos Fc (HRP) (1:3000, #ab97225, Abcam) y anti-SARS-CoV-2 conjugados con biotina (1 µg/mL, #ab284658, Abcam). Se utilizó anticuerpo anti-β-actina (1:2000, #AF5003, Beyotime Biotechnology) como control interno. IgG anti-conejo conjugada con HRP (1:5000, #7074 S, CST), IgG anti-ratón marcada con HRP (1:1000, #A0216, Beyotime Biotechnology) e IgG anti-rata ligada a HRP (1:3000 , #7077, CST) se usaron como anticuerpos secundarios. Los datos fueron recopilados por el software GeneSys (v1.8.6.0) y analizados por el software Image J (v2.9.0).

Se realizó un ensayo en fase sólida como se describe37. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con CD36 recombinante soluble (100 µl a 1 µg/ml, #CP94, novoproteína) en tampón bicarbonato (PH = 9,6). Después de la saturación, se añadió la proteína E (10-1000 ng/ml, #RP01263, ABclonal Technology) durante 2 h a 37 °C. El complejo CD36-E se incubó con anticuerpo de envoltura anti-SARS-CoV-2 de conejo (4 µg/mL, #NBP3-07959, Novus biológicas) seguido de anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con HRP (1:1000, #7074 S, Tecnología de señalización celular). Después de reaccionar con TMB y detener la reacción, se midió la densidad óptica a 450 nm con un espectrofotómetro.

Se procesó un modelo de embolia pulmonar como se describe34. Se utilizaron ratones WT de 6 a 8 semanas de edad y ratones CD36-/- de la misma edad y sexo. A cada ratón se le administró por vía intravenosa proteína E del SARS-CoV-2 (0,5, 1, 2 o 4 μg por ratón, n.º RP01263, ABclonal Technology). Para la traducción de dosis entre animales de laboratorio y humanos en el desarrollo de fármacos, la dosis en ratones se estimó multiplicando el peso por 12,335. Según este criterio, cuando se inyectaron 0,5 μg por ratón, la concentración resultante en los ratones fue comparable a 30 ng/ml de proteína E en el suero de pacientes con COVID-19. Se utilizó PBS como control negativo. A las 4 h después de la administración, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2% y se inyectó una mezcla de colágeno (170 μg/kg) y epinefrina (60 μg/kg) en 100 μL de PBS en la vena de la cola para inducir embolia pulmonar34. Los ratones fueron sacrificados 5 minutos después de la inyección, y los pulmones se perfundieron y fijaron en una solución de formaldehído al 4% para realizar una tinción adicional con hematoxilina/eosina y inmunofluorescencia.

Se realizó un modelo de estenosis de la VCI como se describe54. Tanto a los ratones WT como a los CD36-/- se les inyectó PBS o proteína E del SARS-CoV-2 (4 μg por ratón, #RP01263, ABclonal Technology) a través de la vena de la cola durante 4 h. Después del tratamiento, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2% y luego se expusieron la VCI y las ramas laterales después de una laparotomía cuidadosa. Después de la ligadura de todas las ramas laterales de la VCI y la separación de la VCI de la aorta, se fijó una ligadura con una sutura de 7-0 alrededor de la VCI sobre una aguja roma de calibre 30. Luego se retiró suavemente la aguja para restablecer el flujo sanguíneo parcial y se cerró completamente la cavidad abdominal. Los ratones fueron sacrificados después de 18 h y el trombo se recogió, se fotografió y se pesó. El trombo se fijó en formaldehído al 4% para realizar una tinción de inmunofluorescencia adicional. Para observar el efecto de SB203580 (el inhibidor de p38) en el modelo IVC, los ratones fueron pretratados por vía intraperitoneal con SB203580 (10 mg/kg) o DMSO (control negativo) 2 h antes de la administración de la proteína E.

El ensayo de inmunofluorescencia de pulmones de ratón y trombos de IVC se realizó en secciones de 5 μm embebidas en parafina después de la fijación en paraformaldehído al 4%. Las secciones se sometieron a desparafinización, recuperación de antígeno inducida por calor e incubación con solución de bloqueo como se describe55. Para la detección de CD41, se utilizó anticuerpo anti-CD41 de rata (1:200, clon MWReg30, n.° 553847, Becton Dickinson Biosciences) conjugado con Alexa Fluor 488 mediante el uso del kit de etiquetado de anticuerpos Alexa Fluor™ 488 (n.° A20181, Invitrogen). Para la detección de CD36 y proteína E, se utilizan anticuerpos anti-CD36 de ratón (1 µg/mL, SMφ, #sc-7309, Santa Cruz) y anticuerpos anti-SARS-CoV-2 E de conejo (0,5 µg/mL, #NBP3-07060, Novus biológicos), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con CY3 (1:500, #AP132C, Sigma-Aldrich) y CY5 (1:1000, #AP500S, Sigma-Aldrich), respectivamente. La contratinción nuclear se realizó utilizando DAPI (Invitrogen). Las diapositivas fueron examinadas por un escáner MIDI Pannoramic (3DHISTECH).

Para realizar la tinción de inmunofluorescencia de plaquetas, aislamos plaquetas humanas tanto de pacientes con COVID-19 como de donantes sanos. Estas plaquetas se lavaron con PBS y se cultivaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con 20 µg/ml de fibrinógeno. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C durante 60 min. Posteriormente, las plaquetas en expansión se fijaron, bloquearon y tiñeron usando anti-CD36 no conjugado (1 µg/mL, FA6-152, #ab17044, Abcam) y anti-SARS-CoV-2 E (0,5 µg/mL, #NBP3- 07060, productos biológicos Novus) anticuerpos. Para visualizar la tinción, utilizamos anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (1:500, #A0423, Beyotime Biotechnology) y Alexa Fluor 594 (1:200, #33212ES60, YEASEN), respectivamente. Las imágenes resultantes se capturaron utilizando un microscopio Zeiss y se analizaron utilizando el software Image J (v2.9.0, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 26 (SPSS, Chicago, IL). Los datos se presentaron como medias ± SEM o medias ± DE, según se indica. Se probó la normalidad y la varianza igual de los datos antes del análisis paramétrico. Se utilizó la prueba t de Student, ANOVA de 1 vía, ANOVA de 2 vías, prueba de Kruskal-Wallis, prueba U de Mann-Whitney, prueba de correlación de Spearman, prueba de correlación de Pearson o prueba exacta de Fisher, según correspondiera. El método de análisis estadístico utilizado para cada experimento se indicó en la sección de leyenda. Los gráficos se generaron utilizando el software GraphPad Prism 9. Se utilizó FlowJo V10.4.0 para el análisis de citometría de flujo. Todas las pruebas fueron bilaterales. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en la base de datos GEO (Gene Expression Omnibus) con el código de acceso GSE214150. Las lecturas limpias se asignaron al genoma de referencia (versión del genoma n.° GCF_000001405.39_GRCh38;). Los datos proteómicos de espectrometría de masas generados en este estudio se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (//proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios de iProX con el código de acceso PXD037073. Los datos de las proteínas de membrana se buscaron en la base de datos del proteoma de referencia humana UniprotKB (http://www.uniprot.org/, actualizada al 10 de diciembre de 2021). Todos los demás datos están incluidos en el artículo y en los materiales complementarios. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo contó con el apoyo del Programa Nacional de I+D de Tecnología Clave de China (2021YFC2501300) y el Programa de Vela de Shanghai (22YF1425700).

Estos autores contribuyeron igualmente: Zihan Tang, Yanyan Xu, Yun Tan, Hui Shi, Peipei Jin, Yunqi Li.

Departamento de Reumatología e Inmunología, Hospital Ruijin, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, No. 197 Ruijin Second Road, Shanghai, 200025, China

Zihan Tang, Hui Shi, Jialin Teng, Honglei Liu, Haoyu Pan, Qiongyi Hu, Xiaobing Cheng, Junna Ye, Yutong Su, Yue Sun, Jianfen Meng, Zhuochao Zhou, Huihui Chi, Chengde Yang y Tingting Liu

Departamento de Bioquímica y Biología Celular Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, 280 South Chongqing Road, Shanghai, 200025, China

Yanyan Xu y Junling Liu

Instituto de Hematología de Shanghai, Laboratorio Estatal Clave de Genómica Médica, Centro Nacional de Investigación de Medicina Traslacional en Shanghai, Hospital Ruijin, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200025, China

Yun Tan, Yunqi Li, Feng Liu y Saijuan Chen

Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Ruijin, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200025, China

Peipei Jin, Xuefeng Wang y Jing Dai

Departamento de Radiología, Hospital Ruijin, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200025, China

Yonglu

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Contribución: TL, SC, CY, YT y JD concibieron y diseñaron el estudio. ZT, TL, YX, PJ y YL (Yunqi Li) realizaron los experimentos. SC, YX, FL, YT y ZT escribieron el manuscrito. HS, HP, JT, HL, QH, XC, JY, YS (Yutong Su), JM, ZZ, HC participaron en la recopilación de datos clínicos y análisis de datos, YS (Yue Sun), XW, JL, YL (Yong Lu ) ayudó a verificar los datos. Todos los autores revisaron y editaron críticamente el manuscrito.

Correspondencia a Feng Liu, Jing Dai, Chengde Yang, Saijuan Chen o Tingting Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Tang, Z., Xu, Y., Tan, Y. et al. CD36 media la activación plaquetaria y la trombosis inducidas por la proteína de la envoltura del SARS-CoV-2. Nat Comuna 14, 5077 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40824-7

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Recibido: 03 de marzo de 2023

Aceptado: 10 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40824-7

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