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Aug 02, 2023

Responder a: Antibióticos y orden hexagonal en la membrana externa bacteriana

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 4773 (2023) Citar este artículo 861 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics El artículo original se publicó el 9 de agosto de 2023 en respuesta a G. Benn et al.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4773 (2023) Citar este artículo

861 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

El artículo original fue publicado el 9 de agosto de 2023.

respondiendo a G. Benn et al. Comunicaciones de la naturaleza https://doi.org/10.1038/s41467-023-40275-0 (2023)

Benn et al. comentan que las redes hexagonales observadas en los parches de la membrana externa (OM) tras la adición de polimixina podrían estar formadas por proteínas de la membrana externa (OMP). Suponen que los lipopolisacáridos (LPS) sobresalen por encima de las OMP, lo que podría ocultarlas e impedir que AFM pueda visualizarlas. Además, especulan que la polimixina de alguna manera ordena las moléculas de LPS, de modo que la red OMP oculta se revela al agregar polimixina. De hecho, esto, o que la polimixina induzca otros cambios biofísicos en la membrana, son posibles escenarios que podrían derivarse de nuestro estudio1 y que requerirán más investigación, posiblemente con modalidades de imágenes temporales o espaciales más altas.

Durante décadas se ha establecido que las OMP pueden ensamblar diferentes conjuntos densamente empaquetados en membranas lipídicas, cuya geometría depende de múltiples parámetros, incluida la composición de los lípidos, los electrolitos y el protocolo de incubación2. Nuestros parches de membrana de vesículas de membrana externa (OMV) liberadas de forma nativa de Escherichia coli y fotografiadas mediante AFM de alta resolución muestran regiones de diferentes densidades de OMP, es decir, con un ensamblaje denso de OMP, un ensamblaje escaso de OMP o casi desprovistos de OMP ( Figuras 1a-f). A partir de dichas membranas OMV, así como de los trímeros OmpF reconstituidos artificialmente en membranas de fosfolípidos como redes cristalinas, se puede medir que las OMP sobresalen con sus dominios extracelulares considerablemente de la superficie de la membrana para que puedan ser fotografiadas directamente por la punta del AFM de escaneo (Fig. 1). En nuestras OMV, las regiones densamente empaquetadas de OMP son más raras en comparación con las regiones sin OMP, que presumiblemente son solo lípidos porque sobresalen menos que las OMP.

a – c Imágenes de altura AFM de OMV recopiladas de E. coli que sobreexpresan OMP. una imagen general de altura de AFM de un OMV enriquecido en OMP Tsx8. Tras la adsorción a la mica, las OMV se abrieron como parches de membrana de una sola capa. b Región de (a) fotografiada con mayor resolución. La membrana contiene partículas densamente distribuidas que sobresalen de la membrana. c Imagen de altura de alta resolución que revela OMP (protuberancias únicas) en disposiciones densamente empaquetadas. d, e Imagen general de altura de AFM de un OMV enriquecido en OMP BamA9. Las áreas densamente empaquetadas de BamA parecen más altas (amarillas, alturas de 10 a 15 nm) que la membrana circundante (alturas de 5 a 8 nm). f Superficie extracelular de trímeros OmpF en una membrana que contiene lipopolisacárido (LPS) y lípidos de E. coli7. g Superficie extracelular del modelo atómico de trímeros OmpF renderizados a 3 Å (h, i) Imágenes de altura AFM de alta resolución de redes de porina OmpF 2D ensambladas en membranas lipídicas que contienen LPS y fosfolípidos5. Los dominios extracelulares formados por los largos bucles OmpF sobresalen 1,3 nm de la membrana. Se muestran trímeros OmpF ensamblados en disposiciones de empaquetamiento rectangulares (h, 13,5 nm × 8,2 nm) o trigonales (i, 8,2 nm). Las imágenes AFM representan imágenes de altura tomadas en solución tampón. El rango de brillo de las imágenes de altura del AFM corresponde a un rango vertical de 16 nm (a), 4 nm (b), 1 nm (c), 30 nm (d, e), ≈ 1-2 nm (f) y 1,5 nm (h, i). Las imágenes de altura (f, h, i) se muestran como vistas en perspectiva. Barras de escala, 200 nm (a), 50 nm (b) y 20 nm (c), 160 nm (d), 130 nm (e), 10 nm (f) y 5 nm (g – i). Las imágenes fueron tomadas de (a – c) ref. 8, (d, e) ref. 9, (f) ref. 7, y (g – i) ref. 5.

Tras la adición de polimixinas a dichos parches OMV, observamos que la mayoría de las grandes áreas de superficie que antes estaban vacías se cubren con celosías hexagonales.

Esta formación se produce de manera muy similar, independientemente de la composición de OMP de los parches de membrana. Los OMV recolectados de la cepa MG1655 de tipo salvaje de E. coli (Fig. 2), así como los OMV de la cepa BL21(DE3)omp8 de E. coli, de la cual se han eliminado genéticamente los OMP más abundantes, incluidos OmpF, OmpC y otros, muestran las mismas estructuras reticulares. Las membranas OMV de la cepa BL21 (DE3) omp8 comprenden principalmente lípidos, como lo indican las imágenes de altura de AFM de baja y alta resolución (Fig. 1d, e), y en línea con la alta capacidad de esta cepa para incorporar OMP sobreexpresadas3. También observamos las mismas estructuras cuando las OMV recolectadas de la cepa BL21 (DE3) omp8 se enriquecen específicamente con OmpG o BamA monoméricos. Por lo tanto, la formación de redes hexagonales no parece requerir que una OMP específica esté presente en gran abundancia. Sin embargo, también está claro que las OMP inicialmente presentes en la membrana se incluyen de alguna manera en las redes hexagonales porque con frecuencia observamos parches de membrana completos cubiertos por redes tras la adición de polimixina (Fig. 2).

Imágenes de altura AFM de múltiples membranas de OMV registradas en solución tampón a temperatura ambiente. Cada membrana OMV se muestra antes y después de la adición de polimixina. Los cuadros blancos indican dónde se registraron las imágenes de altura del AFM para mostrar la apariencia de la superficie de la membrana en mayor resolución. La ausencia de detalles estructurales indica que las regiones de la membrana carecían de OMP y contenían principalmente lípidos o que las OMP no se podían resolver. Un indicativo de agregar polimixina a las membranas OMV es que reducen el espesor, aumentan el área de superficie y están cubiertas completamente con celosías hexagonales. Las OMV de la cepa WT de E. coli MG1655, la preparación de la muestra de AFM y las imágenes de AFM se prepararon como se describe1. El rango de brillo de las imágenes de altura del AFM corresponde a un rango vertical de 18 nm (resumen) y 2 nm (zoom in). Barras de escala, 200 nm (resumen) y 20 nm (acercamiento).

Curiosamente, en las cepas MG1655 ∆waaG y MG1655 ∆waaC, que tienen un LPS modificado pero una composición proteica de tipo salvaje, observamos alteraciones en las estructuras cristalinas inducidas por polimixina en comparación con MG1655 de tipo salvaje. Si la red involucra OMP, su disposición precisa está mediada por las moléculas de LPS y se requiere LPS de tipo salvaje para las redes hexagonales bien ordenadas. Además, en estas cepas los polisacáridos están genéticamente acortados, pero no se observa ninguna red en ausencia de polimixina.

Con respecto al modelo alternativo propuesto por Benn et al, será necesario aclarar varios puntos: En primer lugar, ¿cómo es posible el ocultamiento de las redes OMP mediante LPS? Los LPS necesitarían sobresalir más que las OMP, pero ya en ausencia de polimixina, nosotros y otros observamos que las OMP sobresalen más que la superficie de la membrana fotografiada sin OMP.

Además, ¿cuál es la identidad del OMP que forma las redes ocultas? Parece poco probable que se trate de redes OmpF. Los trímeros OmpF pueden ensamblar diferentes redes, de las cuales la hexagonal muestra una periodicidad de 8 a 9 nm2,4. La obtención de imágenes de OmpF trimérico reconstituido en membranas lipídicas u OMV en condiciones de imagen AFM suficientemente bien ajustadas puede proporcionar una resolución que permita un ajuste inequívoco de la estructura de rayos X (Fig. 1f-i). Los trímeros muestran consistentemente grandes dominios extracelulares que sobresalen entre 0,8 y 1,3 nm de la superficie de la membrana y aparecen a distancias de ≈4 nm4,5,6,7. Por lo tanto, aunque algunos de los parámetros de la red coinciden, otros parámetros no coinciden en absoluto. Además, las redes se observaron en la cepa de E. coli BL21(DE3)omp8, que carece de OmpF.

Además, ¿cómo se oculta la red en el caso de cepas con LPS fuertemente truncado? Las cepas MG1655 ∆waaG y MG1655 ∆waaC tienen cadenas de polisacáridos tan cortas que es difícil imaginar cómo pueden cubrir OMP enteras.

Y finalmente, ¿cómo ordena la adición de polimixina al LPS que revele las redes?

En general, parece que todavía queda mucho que aprender sobre la ultraestructura de las membranas externas bacterianas y sus interacciones con los antibióticos dirigidos a los lípidos.

Las OMV producidas a partir de diferentes cepas de E. coli MG1655 se adsorbieron en mica recién escindida durante 15 minutos en tampón DPBS a temperatura ambiente. Después de la adsorción, la muestra se lavó suavemente con tampón DPBS nuevo cinco veces para eliminar las OMV no adsorbidas. Luego, se tomaron imágenes de los OMV utilizando AFM basado en curva de fuerza-distancia (AFM basado en FD) realizado con un AFM (Nanoscope Multimode 8, Bruker) operado en modo PeakForce Tapping en solución tampón (DPBS) a temperatura ambiente. El AFM estaba equipado con un escáner piezoeléctrico de 120 μm y una celda de fluido. Las imágenes se registraron utilizando dos voladizos AFM diferentes: PEAKFORCE-HiRs-F-A (Bruker) con una constante de resorte nominal de 0,4 N/m, una frecuencia de resonancia de ≈165 kHz en líquido y una punta de silicio afilada con un radio nominal. de ≈1 nm o SCANASYST-FLUID + (Bruker) con una constante de resorte nominal de 0,7 N/m, una frecuencia de resonancia de ≈150 kHz en líquido y una punta de silicio afilada con un radio nominal de ≈2 nm. Antes de obtener imágenes, los voladizos se calibraron mediante rampas en la superficie de mica y el método de ajuste térmico. Las imágenes se registraron a una frecuencia de oscilación de 2 kHz, aplicando una fuerza de imagen de 100 a 120 pN con una amplitud vertical de 30 nm. El AFM se colocó dentro de una caja casera con aislamiento acústico y temperatura controlada. Las imágenes se recopilaron en una escala de tiempo de minutos. Las imágenes AFM sin procesar se procesaron utilizando el software de análisis AFM Nanoscope v.1.8 para nivelar y aplanar.

Esta respuesta no contiene datos originales. Los datos mostrados han sido publicados previamente y se hace referencia en consecuencia.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia a través de la subvención 187170 a SH y el Centro Nacional de Competencia en Investigación AntiResist (180541).

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas, Instituto Federal Suizo de Tecnología (ETH) Zurich, Mattenstrasse 26, 4058, Basilea, Suiza

Selen Manioglu y Daniel J. Müller

Biozentrum, Universidad de Basilea, Spitalstrasse 41, 4056, Basilea, Suiza

Seyed Majed Modaresi y Sebastian Hiller

Departamento de Química y Biología Molecular, Universidad de Gotemburgo, Göteborg, 405 30 Göteborg, Suecia

johannes thoma

Laboratorio de Química Física, ETH Zurich, 8093, Zurich, Suiza

Sarah A. General y Alexander B. Barnes

Spexis AG, 4123, Allschwil, Suiza

Gregory Upert y Daniel Obrecht

Bachem AG, 4416, Bubendorf, Suiza

Anatol Lutero

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SM, SMM, JT, SO, GU, AL, AB, DO, DM y SH contribuyeron igualmente a la interpretación de los resultados y a la redacción del manuscrito.

Correspondencia a Daniel J. Müller o Sebastian Hiller.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Reimpresiones y permisos

Manioglu, S., Modaresi, SM, Thoma, J. et al. Responder a: Antibióticos y orden hexagonal en la membrana externa bacteriana. Nat Comuna 14, 4773 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40276-z

Descargar cita

Recibido: 31 de enero de 2023

Aceptado: 19 de julio de 2023

Publicado: 09 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40276-z

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